脊髓灰质炎Sabin株假病毒的构建及生物学特性研究

发布时间：2020-03-30 00:10

【摘要】：脊髓灰质炎病毒(Poliovirus),简称脊灰病毒,属微小核糖核酸(RNA)病毒科(Picomaviridae),是无包膜的单股正链RNA病毒。因为疫苗的接种脊髓灰质炎的流行得到了有效的控制,消灭脊灰后包括减毒株在内的所有活病毒都要被封存,在脊灰后时代探索脊灰假病毒评价人体免疫力的效果具有重要价值。本研究建立了构建Sabin II型的假病毒颗粒PVS2的方法,并对PVS2的生物学特性进行研究,确定其用于后续实验的有效性,为后期利用假病毒进行中和实验奠定了基础。实验研究中,通过同源重组法构建表达衣壳蛋白的质粒pcDNA-P1-S2和含有报告基因的骨架质粒pRepGL。然后分别利用体内和体外合成的Replicon制备假病毒:依次转染 pcDNA-P1-S2 与由 pRepGL 体外转录的 Replicon RNA;共转染 pcDNA-P1-S2、pRepGL和表达T7 RNA聚合酶的质粒pCAG-T7-puro,两种方法得到的PVS2荧光素酶活性无显著差异。从转染试剂、培养基成份、293T的胞龄、质粒的比例4个方面进行探索后,PVS2的荧光素酶活性为1.2×105RLU。收获的假病毒PVS2经鉴定是直径约30 nm的颗粒,形态结构与原病毒相似,具血清特异性,可与中和抗体有效结合,制备的假病毒可以通过荧光素酶和荧光蛋白的活性检测假病毒滴度,其中荧光素酶检测灵敏度较高,用该方法检测PVS2的滴度为4.0 LgIU/mL。同时以SabinⅡ型的replicon为母本,与SabinI型和III型的衣壳蛋白P1基因重配,获得的重组病毒用不同型别的抗体检测后确定具有血清特异性。综上所述此次研究对转染条件进行了探索并首次建立了运用胞内转录的Replicon RNA制备Sabin株脊灰病毒假病毒颗粒的方法,制备得到的Sabin假病毒颗粒PVS2的形态、血清型和抗原性与Sabin株活病毒相似;II型Replicon与SabinI型、III型的衣壳蛋白P1基因重配后获得了具血清特异性的重组I、III型假病毒颗粒Re-PVS1、Re-PVS3。
【图文】：

建逡逑表达质粒ｐｃＤＮＡ－Ｐｌ的构建逡逑炎Ｓａｂｉｎ株ＩＩ型病毒经过ＲＮＡ的提取，ＲＴ－ＰＣＲ获得了Ｐ卜Ｓ２基因样品为单一带型且片段分子量大小与预期相符。因为设计引了与载体序列相重叠的序列，目的片段可以通过同源重组与ＦＰ邋（６１８０ｂｐ）相连接，连接好的质粒可以用五。爪NB酶切后获酶切的质粒（４道）为环状结构，在电泳过程中分为了２个条粒超螺旋状态的较多，适合用于转染。在合成ＰＣＤＮＡ３．１－ＧＦＰ钱入了邋２Ａ酶切位点识别序列，保证蛋白在合成过程中ＧＦＰ与Ｐ１式存在。连接成功的质粒ｐｃＤＮＡ－Ｐｌ－Ｓ２经ＰＣＲ鉴定，ｆｃｏＲＶ示鉴定获得片段分子量大小与预期一致，且测序结果显示片段ＤＮＡ－Ｐｌ－Ｓ２图谱见附件。逡逑

由质粒ｐＧＦＰ－Ｎｌ和ｐＮＬ４．３ＰＣＲ获得，其分子量大小分别为７７７ｂｐ和１１４２ｂｐ。５ＵＴＲ和ＧＦＰ逡逑因分子量较小，可以通过重叠ＰＣＲ（邋ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ）进行连接，获得的目的条带５ＵＴＲ－逡逑ＧＦＰ的大小为１５２８邋ｂｐ，从图１．２中可以看出在ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ产物杂带较多，可能是因逡逑为引物特异性较差造成的非特异性扩增。为了保证条带的特异性，回收时分别将两条逡逑分子量接近的条带回收，再用引物扩增鉴定。为了保证ＰＣＲ产物不发生突变同时也方便逡逑后续操作，５ＵＴＲ－ＧＦＰ，邋Ｐ２，邋Ｐ３三个部分的基因片段均经ＴＡ克隆后分别连接到Ｔ载体逡逑ｐＧＥＭＴ，邋ｐＭＤ１８－Ｔ上，测序正确后再进行连接反应。其中５ＵＴＲ－ＧＦＰ直接连接至［ＪｐＧＥＴ逡逑的Ｔ７启动子后面，用于后续转录ＲｅｐｌｉｃｏｎＲＮＡ。用于连接的片段ｌｕｃ、Ｐ２、Ｐ３包含了与逡逑前后片段重叠的区域，所以多个目的片段可通过同源重组直接连接到线性化的ｐＧＭＥＴ－逡逑５ＵＴＲ－ＧＦＰ上，最终获得质粒ｐＲｅｐＧＬ，，在该载体上目的基因按Ｔ７启动子－５ＵＴＲ－ＧＦＰ２Ａ－逡逑Ｌｕｃ－Ｐ２－Ｐ３的顺序连接
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.22

【参考文献】

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1 袁志刚,张进平,储以微,王缨,徐薇,熊思东;原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究[J];生物工程学报;2005年02期

本文编号：2606721