Klf6a参与血流动力学调控斑马鱼尾部静脉丛修剪的研究

发布时间：2020-03-30 04:40

【摘要】：血管网络是一个复杂、精细的三维网络,负责为机体提供氧气和能量的同时排出废物,是生物体内极其重要的组织器官。血管的过度生长、减少或者功能障碍都可能导致多个系统发生病变。血管网络在发育过程中尽管在不断形成,但其三维网络结构却在不断简化,分级逐渐明显。科学家们发现血管网络形成后的简化过程是由处于局部复杂网络中的血管融合或消失造成的,该过程也被称之为血管修剪,近年来吸引了越来越多研究者的关注。通过利用小鼠视网膜血管、斑马鱼脑部血管、斑马鱼肠系膜血管等模型研究发现,血管修剪这一过程是在血流动力学因素的调控下,通过细胞的凋亡或重排等行为完成的。但是,至今为止还没有课题组利用斑马鱼尾部血管的模型对其血管修剪过程以及参与这一过程的分子机制进行研究。基于以上科学背景,本论文利用多种转基因斑马鱼和激光共聚焦显微镜、Morpholino敲降目的基因、Crispr/Cas9基因编辑技术等一系列实验方法对斑马鱼尾部血管的修剪过程以及参与其中的遗传分子进行了详细的研究,本论文的主要内容和研究结果如下:(1)斑马鱼尾部血管修剪过程的描述。首先利用激光共聚焦显微镜观察斑马鱼尾部血管在发育过程中(1dpf到9.5dpf)的形态变化。然后用Tg(fli:nGFP×flk1:mCherry)转基因斑马鱼统计其发育过程中尾动脉、尾静脉以及尾部静脉丛的细胞数量,根据数量变化规律将尾部血管的修剪过程划分为两个主要阶段:以血管融合为主的尾静脉确定阶段(1.5dpf至2.5dpf)、伴随细胞迁移和凋亡的尾部静脉丛退化阶段(2.5dpf以后)。最后利用斑马鱼整胚免疫荧光实验验证了以上结论的正确性。(2)血流动力学因素调控斑马鱼尾静脉的形成。首先利用血流抑制剂tricaine对斑马鱼胚胎进行处理,通过激光共聚焦观察到tricaine处理后斑马鱼胚胎的尾部静脉丛不能很好地进行融合形成正常的尾静脉。然后利用Time-lapse慢速拍摄的方法对尾静脉的确定过程进行了连续24小时(48hpf至72hpf)的观察,发现血流的有无能够诱导相邻静脉血管之间的融合。以上结果表明,血流动力学因素可以调控斑马鱼尾静脉的形成。(3)klf6a作为力学感受器调控斑马鱼尾静脉的形成。首先,通过体外力学加载的方法对人脐静脉内皮细胞施加不同大小的切应力,培养12个小时后进行qPCR实验,筛选出了表达量随切应力的升高而显著增加的Klf6。然后分别利用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光实验验证了其力学感受作用。其次,特异性沉默和敲除斑马鱼klf6a基因后在胚胎发育至3dpf时利用激光共聚焦显微镜进行观察,发现klf6a的缺失使得尾部静脉丛在形成过程中无法正常进行血管的融合与尾静脉的形成,从而导致整个尾部血管的血流发生紊乱。根据以上结果我们得出结论,klf6a作为力学感受器调控斑马鱼尾静脉的形成。本研究首次对斑马鱼尾部血管修剪过程进行了详细的描述,使其可作为一个新的血管修剪模型用于更多的研究。还筛选出了一个参与血管修剪过程的力学感受分子—Klf6,为后续更加深入的研究提供了方向。
【图文】：

斑马鱼

2 斑马鱼尾部血管的修剪过程2.2.2 斑马鱼的饲养与繁殖本课题中所用野生型斑马鱼 TU、AB，突变体斑马鱼 klf6a-/-，转基因斑马鱼Tg(flk1:GFP)（由清华大学孟安明院士实验室友情提供）和 Tg(nuclear:GFP)（由中国科学院大学动物所刘峰教授实验室友情提供）等，均是在本实验室斑马标准化饲养系统中进行饲养和繁殖的。该标准化系统由四大部分组成，包括：生物培养控制系统、养殖缸、系统水系统和纯水系统，如图 2.1 和图 2.2 所示。

丰年虫

图 2.2 丰年虫的孵化与喂养。A：丰年虫孵化缸。B：孵化出的丰年虫。Figure 2.2 The hatching and feeding ofAnemia. A, Anemia hatching cylinder. B, Hatched anemia.按照斑马鱼标准饲养手册的要求，将斑马鱼饲养系统的系统参数设置如下：斑马鱼饲养间及系统水恒定控制在 28.5±0.5℃、明暗比为 14 小时/10 小时（系统晚22:00 自动关灯，早 8:00 自动开灯）、系统水 pH 为 7.0±0.2（pH 低于 7.0 时会影响斑马鱼产卵质量，因此需每天测定系统水的 pH，当发现 pH 偏低时使用 NaHCO3将其调至正常）。系统水按照斑马鱼标准饲养手册配制，配方如表 2.1 所示。成年斑马鱼的食物是丰年虫，丰年虫需在孵化缸中孵化出壳后才可以使用。孵化时，将丰年虫卵、适量海盐、一蒸水一起加入孵化缸中，搅拌均匀，然后插入增氧泵补充氧气，持续增氧 24 小时后，大部分丰年虫会卵壳分离，此时即可进行喂养。喂养时取出增氧泵，孵化出的丰年虫会慢慢沉到孵化缸的底部，拿盒子接出丰年虫，，用流动的纯水反复冲洗、过滤丰年虫，冲走滞留其中的盐分以及多余的卵壳，最后用纯水进行适当比例的稀释后即可使用。喂养时，根据缸内鱼的数目，用吸管吸取不同量的丰年虫挤入培养缸即可。丰年虫孵化系统配方如表2.2。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R331

【参考文献】