ECDI—凋亡细胞诱导小鼠异体复合组织移植耐受机制的研究

发布时间：2020-03-30 23:01

【摘要】：研究背景:ECDI诱导的早期凋亡细胞已经被作为有效且低毒性的免疫抑制方法应用于治疗自身免疫疾病的临床研究,且在小鼠体内,可诱导胰岛移植供体特异性免疫耐受形成,并且明显延长同种异体心脏及皮片移植的存活时间。但与此同时,ECDI诱导的供体早期凋亡细胞相关免疫抑制机制仍不完全清楚。而M2型巨噬细胞作为非特异性免疫系统成员,在抑制炎症反应,免疫抑制反应中扮演重要的作用。研究目的:探索了供体ECDI-SPs与受体巨噬细胞极化方向的关系,揭示供体ECDI-SPs延长移植物存活时间的相关机制,为此方法进一步的临床治疗应用提供了相应理论基础。研究方法:利用受体小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)与供体小鼠ECDI-SPs体外共培养体系,首先通过流式细胞术,对受体巨噬细胞吞噬ECDI诱导的供体脾脏单个核细胞的吞噬情况进行了检测,并进一步通过共培养体系,利用流式细胞术、RT-PCR以及Western Blot等技术对吞噬后受体巨噬细胞的极化方向、IL-10、IL-6等相关细胞因子的表达以及吞噬后极化方向改变的相应分子机制进行了检测。建立受体小鼠诱导极化后巨噬细胞与脾脏单个核细胞共培养体系,观察极化后巨噬细胞对Treg细胞比例的影响。建立C57/BL6-Balb/c小鼠同种异体皮片移植模型,检测在体情况下受体小鼠接受供体ECDI-SPs注射后,Mφ的极化方向与体外培养是否一致,同时检测Treg比例,同时利用Luminex技术对小鼠血清相关炎症及抑炎分子进行检测。研究结果:受体小鼠Mφ可明确吞噬ECDI处理后供体小鼠脾脏细胞,且吞噬后向M2方向极化,与吞噬未经处理的供体脾脏细胞极化方向截然相反。吞噬ECDI-SPs后受体Mφ的IL-10分子表达显著上调,同时IL-6等炎症因子表达受到抑制。受体小鼠Mφ吞噬ECDI-SPs后,通过增强CREB的磷酸化,促进其自身向M2表型极化。诱导极化为M2型的巨噬细胞可进一步促进Treg细胞比例的上升。在体皮片移植模型情况下,与对照组相比,ECDI-SPs的注射同样可促进受体小鼠体内Mφ向M2型极化,且明显提高了Treg细胞比例,且排斥终点血清IL-10明显升高,同时IL-6、IL-12p70、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平明显降低,最终延长了移植皮片的存活时间。研究结论:Mφ在吞噬同种异体ECDI处理的早期凋亡细胞后,通过增强CREB磷酸化,促进自身向M2方向极化,促进IL-10的分泌,抑制IL-6的生成,进一步提升Treg比例,调控移植排斥反应,延长移植物存活时间。
【图文】：

1 小鼠脾脏淋巴细胞分离后分层情况示体淋巴细胞共培养体系的建立预先贴壁 C57BL/6 小鼠腹腔巨噬细胞中07个），各个孔分别加入 5×107个 分离得/c 小鼠脾脏单个核细胞以及 ECDI 诱导凋腔巨噬细胞对供体早期凋亡细胞的吞噬对脾脏单个核细胞进行 CFSE 染色。具0 的比例稀释冻存的 2mmol/L 的 CFSE 储度。重悬分离得到的小鼠脾脏单个核淋巴光染色 10min。反应结束后，向单个核细冷的 RPMI1640 培养液（含 10%胎牛血

图 2 腹腔巨噬细胞的吞噬检测图 A 为 C57 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬自体及供体 Balb/c 小鼠 SPs 及 ECDI-SPs 的情况，CFSE 与 F4/80 双阳性的细胞可表示吞噬了脾脏细胞的巨噬细胞。图 B 为腹腔巨噬细胞吞噬比例统计图，ECDI 处理后，巨噬细胞的吞噬比例明显上升。*P<0.05。图 C 为巨噬细胞系 RAW264.7 对 SPs 及 ECDI-SPs 的吞噬情况。3.2 Fox-O1 Lysm Cre 条件性敲除小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能检测Fox-O1 分子作为巨噬细胞分泌 IL-10 分子的上游调控因子，在调节巨噬细胞吞噬及相关细胞因子分泌功能方面有一定影响。结合实验室现有条件，即 Fox-O1 LysmCre 条件性敲除小鼠，我们对基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞进行了提取，并利用了同样的共培养体系及方法，对其吞噬功能进行了检测。与野生型小鼠相比，Fox-O1 LysmCre 条件性敲除小鼠对 ECDI-SPs 的吞噬功能有明显的上调。但由于品系以及供体的复杂性，，我们进一步对基因敲除小鼠的选择以及对照组的挑选进行了改进，选取 Cre+的条件敲除小鼠腹腔巨噬细胞作为实验组，以同窝繁殖的 Cre-的条件敲除小鼠腹腔
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2608174