科萨奇病毒A16型VP1亚单位疫苗研究

发布时间：2020-03-31 07:26

【摘要】：柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属,是手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。近年来发现,CVA16感染的病患可引起脑部、肺部和心脏等的继发感染,甚至还可能引发肺炎、心肌炎和难治性休克等致死性并发症。大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是细菌毒素,但是却具有黏膜免疫佐剂活性,LT可以通过增加上皮细胞的渗透性和调节B细胞的分化,来诱导黏膜免疫反应,以及调节细胞因子的产生和T细胞的形成。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),可作为特异性抗原的黏膜佐剂,用以增强特异性抗原的血清IgG抗体应答。大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli type-Ⅱheat-labile enterotoxin B subunit,LT2B)具有比LTB更强的佐剂活性。目的:CVA16VP1与LT2B融合蛋白作为抗原的免疫原性的研究,初步评价产生的抗体的抗体效价,为进一步研究柯萨奇病毒的新型疫苗奠定基础。方法:本实验利用DNA聚合酶对合成的CVA16VP1进行扩增,得到大量的CVA16VP1基因片段,并引入BamH I和EcoR I两个酶切位点,酶切后连入pET32a(+)大肠杆菌表达载体,构建pET32-CVA16VP1表达质粒,并转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。设计引物对LTB扩增得到大量LT2B基因片段,并引入Sal I和Not I酶切位点,酶切后连入pET32-CVA16VP1,构建pET32-CVA16VP1-LT2BO表达载体,并转入BL21感受态细胞。设计引物对pET32-CVA16VP1-LT2BO进行全质粒扩增,引入另一个Eco R I酶切位点,Eco R I单酶切PCR产物,自连得到pET32-CVA16VP1-LT2B表达载体,并转入BL21感受态细胞。通过质粒PCR检测,酶切检测,测序检测确定构建的载体的正确性。在实验室先前的研究基础上,确定诱导蛋白表达的最佳条件,然后进行蛋白诱导表达,通过Western-blot检测目标蛋白表达的正确性,采用His标签磁珠纯化蛋白,TGE透析蛋白复性,聚乙二醇8000(PGE8000)对纯化好的低浓度蛋白进行浓缩,得到高纯度浓度的CVA16VP1-LT2B融合蛋白。使用CVA16VP1-LT2B蛋白,通过滴鼻的方式免疫Balb/c小鼠,收集小鼠的血清,采用间接ELISA法检测血清中特异性抗体IgG水平。结果:1.成功构建了p ET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,并成功转入了BL21感受态细胞。2.在BL21中表达了带有his标签的CVA16VP1-LT2B融合蛋白,Western-blot检测到目的条带,约为66KD左右。3.通过三次滴鼻免疫小鼠,获得了小鼠血清,并利用Western-blot检测,小鼠血清中有特异性抗体产生。4.间接ELISA检测小鼠血清中特异性抗体效价结果显示,CVA16VP1-LT2B具有一定的免疫原性,产生的抗体的抗体效价为1:800。结论:成功构建的pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体能够表达具有免疫原性的融合蛋白,并且该融合蛋白是我们的目的蛋白。通过三次共28天的免疫小鼠,能够获得足够的血清并能检测出成功表达了特异性抗体。该抗体具的抗体效价能够通过间接ELISA检测出,为1:800。
【图文】：

CR 鉴定 pET32-CVA16Ve PCR identification of pEL10000）；2：pET32-CV 测 序 结 果 正 确 ， 所达完整的 CVA16VP1-L 达 融 合 蛋 白 CVA验过程中，通过不断尝T32-CVA16VP1-LT2B发现该载体中，LT2B1 2

经诱导表达的融合蛋白经过 10% SDS-PAGE 电泳，Western 检测如图 2.1，蛋小约 66kDa。图 2.1 his 标签鼠抗为一抗，，检测 CVA16VP1-LT2BFigure 2.1 CVA16VP1-LT2B detection with his-tag mouse mAb.2 BCA 标准曲线绘制及蛋白浓度测定结果横坐标为蛋白标准品的浓度，纵坐标为吸光度，使用 EXCEL 绘制标准曲线图如图 2.2，根据标准曲线计算纯化浓缩后蛋白的浓度。根据蛋白标准曲线计 CVA16VP1-LT2B 融合蛋白浓度为 0.862μg/μl。——66kDa
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2608762