低氧预处理人羊膜间充质干细胞生物学特征研究

发布时间：2020-04-01 10:32

【摘要】：目的:研究低氧预处理对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)生物学特征的影响。方法:(1)应用机械法和酶消化法从人羊膜组织中分离提取hAMSCs。(2)将传代至P3代hAMSCs,设置低氧预处理组(3%O_2、5%CO_2)、常氧组(21%O_2、5%CO_2),均预处理48小时,倒置显微镜下观察细胞形态。(3)应用免疫细胞化学和流式细胞仪(FCM)分别对低氧预处理组和常氧组hAMSCs进行波形蛋白和免疫表型鉴定。(4)对低氧预处理组和常氧组hAMSCs进行成骨、成脂肪诱导分化培养,诱导3周后通过茜素红和油红O染色评价hAMSCs分化情况。(5)CCK-8(Cell Counting Kit-8)技术及Edu细胞增殖实验检测低氧预处理组和常氧组hAMSCs增殖活性及DNA合成率。(6)将低氧预处理组与常氧组细胞的hAMSCs分别在无血清培养基饥饿培养24小时,通过Annexin V-FITC/PI流式细胞技术检测hAMSCs凋亡情况。(7)将低氧预处理组和常氧组hAMSCs分别在无血清培养基饥饿培养24小时,收集上清液,应用Proteome Profiler(ARY 007)试剂盒检测hAMSCs上清液中分泌血管生成相关因子含量。(8)实验数据应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。结果:(1)低氧预处理的人羊膜间充质干细胞与常氧培养的人羊膜间充质干细胞形态学观察无明显差异。(2)低氧预处理组与常氧组人羊膜间充质干细胞波形蛋白均阳性表达,PBS对照组阴性;两组hAMSCs免疫表型FCM结果CD44、CD73、CD90、CD105均呈高表达,CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR阴性,两组间无统计学差异(P0.05)。(3)低氧预处理组和常氧组人羊膜间充质干细胞均具有成骨、成脂分化能力。(4)CCK-8结果显示低氧预处理组和常氧组人羊膜间充质干细胞在1~7天的细胞增殖活性均先增加后降低,预处理组在1~7天增殖能力高于常氧组(P0.01);Edu增殖实验结果显示,预处理组DNA合成率(29.50±3.53%)与对照组(16.55±0.78%)比较差异有统计学意义(P0.05)。(5)AnnexinV-FITC/PI的FCM结果说明,在无血清培养条件下低氧预处理组人羊膜间充质干细胞的细胞凋亡(4.87±0.86%)与常氧组(12.31±1.14%)比较有显著的统计学差异(P0.01)。(6)Proteome Profiler(ARY 007)结果显示,低氧预处理组人羊膜间充质干细胞在无血清培养下,上清液含有9种血管相关生长因子(Coagulation factor III、IGFBP、IL-8、MCP-1、Pentraxin E1、Serpin E1、Serpin F1、TIMP-1、Thrombospondin-2),常氧组含有8种(IGFBP、IL-8、MCP-1、Pentraxin E1、Serpin E1、Serpin F1、TIMP-1、Thrombospondin-2),其中IGFBP、Pentraxin E1、Serpin E1、Thrombospondin-2生长因子在预处理组含量(93.28±3.30、143.58±4.15、90.77±1.81、102.76±3.57)与常氧组(74.20±0.78、107.47±2.58、72.90±1.31、81.40±1.25)差异有统计学意义(P0.05)。结论:3%低氧预处理促进人羊膜间充质干细胞的增殖活性、抗凋亡作用和旁分泌功能,并保持干细胞特性。
【图文】：

形态图,相差显微镜,形态

遵义医学院硕士学位论文代敏2 结果2.1 人羊膜间充质干细胞的形态学特征倒置相差显微镜下观察原代 hAMSCs 呈短梭形、椭圆形、多角形及不规则形，贴壁生长（图 1A），2 天后首次换液，5～7 天细胞聚合度达 80%～90%（图 1B）。原代 hAMSCs 中间杂着羊膜上皮细胞，经过控制胰酶消化时间（2～3 min）方法可纯化，传代 1～2 代后的 hAMSCs 细胞形态有高度一致性，，基本呈长梭形，可见细胞呈放射状、旋涡状生长(图 1C、D)。

常氧,形态学特征,间充质干细胞

图 2.hAMSCs 常氧与低氧预处理 48 小时形态学特征Fig 2. Morphology characterization of hAMSCs after normoxic and hypoxic preconditioning for48 hoursA.21% O2浓度下第 3 代 hAMSCs 形态（×40）；B.3% O2浓度下第 3 代 hAMSCs 形态（×40）2.3 低氧预处理人羊膜间充质干细胞的表型鉴定2.3.1 低氧预处理 hAMSCs 免疫细胞学鉴定结果免疫细胞化学染色结果显示，N-hAMSCs 组与 Hp-hAMSC 组间充质细胞标志物波形蛋白均表达阳性（图 3a、A），PBS 对照组阴性（图 3b、B）。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】