分枝杆菌RD-1区部分基因重组卡介苗的构建及其免疫活性的研究

发布时间：2020-04-01 14:13

【摘要】：肺结核是由结核分枝杆菌引起的一类人畜共患慢性传染疾病,严重威胁人类及患病动物的健康。目前,卡介苗仍然是世界范围内公认的肺结核疫苗,但是由于地域、年限的差异导致卡介苗的保护效力不断的下降,这可能是由于传代过程中某些功能基因的缺失,因此人们积极寻求卡介苗的改良方法以期提高其保护力。结核分枝杆菌的RD-1区(Region of difference,1)是卡介苗同致病性分枝杆菌相比缺失的区域,由Rv3871-Rv3879c 9个基因构成,RD-1区编码的蛋白在结核分枝杆菌侵染机体的过程中发挥巨大的作用。随着结核分枝杆菌基因组测序工作的完成,对结核分枝杆菌的研究进入分子水平,将RD-1区基因重组载体导入卡介苗表达蛋白或为肺结核疫苗的改良提供新的思路。本实验首先运用分子生物学技术获得大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261-RD-1区基因重组质粒6个,利用电穿孔法将构建成功的部分重组质粒转化至卡介苗中,构建重组卡介苗,经培养得到重组卡介苗菌株。利用培养的重组卡介苗免疫动物,分别在免疫后的第6周和第12周对样品进行检测,通过检测实验动物脾淋巴细胞增殖情况,抗体水平变化情况以及小鼠脾淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ、NO含量来观察小鼠体内免疫情况并对数据进行分析,实验结果如下所示:1、本实验利用分子生物学技术获得6个RD-1区重组穿梭质粒即pMV-261-Rv3872、pMV-261-Rv3873、pMV-261-Rv3874、pMV-261-Rv3875、pMV-261-Rv3876、pMV261-Rv3877。2、利用电转化技术成功获得3个重组卡介苗即rBCG:ESAT-6、rBCG:EspI、rBCG:Snm4,重组卡介苗的生长曲线同卡介苗相比未发生明显的变化,可以用于后续免疫实验。3、免疫后每周称量实验动物的体重,发现注射卡介苗、重组卡介苗的小鼠同注射PBS组的小鼠相比,体重未发生明显变化,注射的重组卡介苗没有影响动物的生长。4、抗体效价检测结果:免疫6周后,各实验组组血清中IgG水平同PBS组相比均极显著上升(P0.01),免疫12周后,抗体效价有所降低,BCG组及rBCG:ESAT-6组血清中IgG水平同PBS组相比显著上升(P0.05)。rBCG:ESAT-6免疫动物血清的效价稍低于BCG组,但是能够保持长时间的高水平抗体效价。5、脾淋巴细胞增殖实验结果表明同PBS组相比,rBCG:ESAT-6组的脾淋巴细胞在受到PPD刺激时,能够在免疫后第六周极明显(P0.01)的刺激脾淋巴细胞增殖;免疫12周后,PPD刺激后rBCG:ESAT-6组SI(实验组与对照组吸光度的比值,比值大于1则为阳性)极为显著(P0.01),BCG组差异显著(P0.05)。同PBS组以及BCG组相比,rBCG:ESAT-6组能够维持较高的细胞免疫水平。6、INF-γ检测结果表明:免疫6周、12周后,同PBS组相比较,各实验组小鼠脾细胞上清中IFN-γ的产量均显著增加(P0.01)。7、NO检测结果表明:免疫6周后,各实验组的脾淋巴细胞受到PPD刺激时,NO的表达水平同PBS组相比均极为显著(P0.01);免疫12周后,BCG组及rBCG:ESAT-6组的脾细胞受到PPD刺激时,NO的表达水平同PBS组相比均极为显著(P0.01),rBCG:EspI、rBCG:Snm4组NO生成量差异显著(P0.05)。
【图文】：

模式图,模式图,分枝杆菌,孔膜

白的结构和功能发生改变，最终导致相应 T 细胞表位够特异性应对宿主压力的抗原，参与了分枝杆菌逃分泌10 是 RD-1 区编码的毒力蛋白，，能够通过形成孔膜破 ESX-1(ESAT-6 secretion system-1)系统分泌。ESX-枝杆菌侵染宿主细胞的过程中调节分枝杆菌胞内转Snm2、EspI、Snm4、EsxC 作为 RD-1 区的四种蛋白识别、结合和分泌的作用进而辅助 ESAT-6、CFP-1

示意图,载体,示意图,基因重组

第二篇研究内容杆菌 RD-1 区部分基因重组穿件Primer5.0设计了结核分枝杆菌RD-1行合成。利用克隆技术获得 RD-1 区基因重组穿梭载体，利用双酶切和测序技873 、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv38杆菌感受态细胞 DH5α 由本实验室保存与流行病学中心提供。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】