过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用的探究

发布时间：2020-04-04 22:41

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病,随着年龄增加,其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少,从而导致Snc-纹状体通路中DA释放减少。PD病因和致病机制目前尚不清楚,其并非单一因素所致,而是年龄、环境、遗传等因素交互作用的结果。目前临床上无药物能够减缓阻止及逆转DA能神经元变性过程。无论是药物治疗,还是手术治疗,都不能根治PD,且会产生明显副作用。PD主要病变是Snc部DA能神经元丢失导致纹状体内DA水平下降,且PD患者脑中病变部位明确,因此PD成为神经系统病变中进行基因治疗热门病种。本文中,通过构建过表达多巴胺脱羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)环化水解酶(GTP cyclihydrolase1,GCH1)的重组慢病毒(recombinant lentivirus,rLV),将DDC+TH+GCH1-rLV注射至6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备的PD模型大鼠纹状体中,观察病毒在PD大鼠脑内的表达情况及大鼠的旋转行为学改变。采用携带产酶基因重组病毒载体,在动物模型中进行治疗,拟重建纹状体DA水平,以期待达到预期治疗效果。第一部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV及对照rLV制备及鉴定目的构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV载体。方法PCR扩增各目的基因片段DDC、SV40 early promoter、TH、mPGK promoter、GCH1,使用BamHI-HF和XhoI对载体pMT174(pLV-RSV-CMV-WPRE)进行酶切,回收载体片段备用。进而在无缝反应液作用下,将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组。利用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序,测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞进行病毒包装,经纯化、浓缩后保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定。取出DDC+TH+GCH-rLV及对照rLV冰上融化,感染HEK293T细胞。72 h后,提取总蛋白,对DDC、TH、GCH1进行Western blot检测。结果PCR结果显示,在1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp处可见特异性目的基因DDC,SV40 early promoter,TH,mPGK promoter,GCH1目的基因条带;使用BamHI-HF和XhoI对工具载体pMT174进行酶切,回收6508 bp载体片段;菌落PCR转化子鉴定结果显示,阳性克隆得到1436 bp片段;测序结果正确;与辅助质粒共转染HEK293T细胞,72小时后获得DDC+TH+GCH1-rLV和对照rLV颗粒,经过纯化浓缩后-80℃保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定,分别为5.56×10~8 v·g·mL~(-1)、1.07×10~9 v·g·mL~(-1)。Western blot结果可见,DDC+TH+GCH1-rLV感染组在3种DDC、TH和GCH1蛋白相对分子质量处可见特异性的蛋白分子表达条带。结论成功构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV,其浓度及所携带基因功能满足后续实验需要。第二部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV在PD大鼠模型中的作用探究目的评价DDC+TH+GCH1-rLV对PD大鼠模型的治疗效果,检测目的基因是否正确表达。方法大鼠6-OHDA MFB两点法立体注射,构造单侧损毁PD模型。挑选完全损伤模型,其标准为旋转圈数每分钟7圈,或30分钟210圈。运用Snc部TH免疫荧光,检测PD大鼠DA能神经元损毁情况。24只PD大鼠模型分为随机分为三组:生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体三点注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果6-OHDA MFB两点法立体注射构建PD大鼠模型,符合PD大鼠旋转行为标准,挑选PD模型大鼠。PD大鼠Snc部TH免疫荧光结果显示:损毁侧DA能神经元大量丢失(P0.01),行为学观察及免疫荧光检测证明PD模型构建成功。PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P0.01);阳性病毒组呈现出显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组间比较,显著增高(P0.01)。结论DDC+TH+GCH1-rLV在PD模型大鼠中呈现出显著的行为改善,DA水平增加及稳定的目的基因表达。
【图文】：

PCR扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,载体,琼脂糖凝胶

南京医科大学硕士学位论文结果1、PCR 扩增各目的基因琼脂糖凝胶及表达载体 pMT174 酶切结果以人工合成的 cDNA 为模板，引物(表 1)扩增各目的基因，结果在 1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp 处可见特异性目的基因 DDC，SV40 earlypromoter，TH，mPGK promoter，GCH1 目的基因条带(图 1)。琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收各目的基因备用。用 BamHI-HF 和 XhoI 对工具载体 pMT174 进行酶切，回收 6508 bp 载体片段(图 2)，工具载体备用。

琼脂糖凝胶,表达载体,基因扩增,载体

TH，，mPGK promoter，GCH1 目的基因条带(图 1)。琼脂糖凝胶 D剂盒回收各目的基因备用。用 BamHI-HF 和 XhoI 对工具载体 pMT174，回收 6508 bp 载体片段(图 2)，工具载体备用。图 1 各目的基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果道为 DDC 基因扩增产物，2 泳道为 SV40 early promoter 基因扩增产物，3 泳道扩增产物，4 泳道为 mPGK promoter 基因扩增产物，5 泳道为 GCH1 基因扩增产NAladder Marker。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5;R-332

【参考文献】