猪IFITM通过与ABHD16A相互作用抑制乙型脑炎病毒研究

发布时间：2020-04-04 22:45

【摘要】：日本乙型脑炎(Epidemic encephalitis B)是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染而引发的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒在全世界范围内危害严重。干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon-induced transmemberane proteins,IFITMs)是受干扰素(Interferon,IFNs)诱导的小分子跨膜蛋白,研究显示IFITM家族蛋白具有广谱抗病毒的能力。实验室前期研究初步证明猪源干扰素诱导的跨膜蛋白(sIFITMs)具有抑制JEV作用,为进一步研究其作用机制和在乙型脑炎发生发展中的作用,开展了相关研究,研究结果如下:1、采用荧光定量PCR检测过量表达IFTIMs时JEV的复制。结果表明,在PK15、HEK293细胞中,过表达sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3蛋白,在24h、48h、72h均显著抑制JEV病毒的复制,其中sIFITM1具有较强抑制病毒复制的能力。为进一步验证sIFITM1对病毒复制的影响,通过CRISPR/cas9技术在PK15细胞和ST细胞中敲除sIFITM1,结果显示,在24h,缺失sIFITM1能显著提高JEV病毒复制。2、为了探讨sIFITMs的抗JEV机制,筛选并研究其相互作用蛋白。采用酵母双杂交试验证实了sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A均存在相互作用关系。在PK15、HEK293细胞中,通过亚细胞共定位,发现sIFITM1与sABHD16A存在共定位膜性结构上,且在JEV感染细胞后,sIFITM1与sABHD16A的共定位区域随着病毒的感染发生转移。3、通过在BHK21、L02、HEK293细胞中过表达sABHD16A,24h、48h、72h检测细胞培养上清,结果表明sABHD16A显著抑制JEV病毒复制。构建CRISPR/cas9敲除载体pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a,在PK15、ST细胞中敲除sabhd16a,该细胞感染JEV 24h后,与对照组相比具有差异性显著提高JEV复制。4、将pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a转染HEK293细胞,筛选并构建了单克隆稳定缺失sABHD16A~(-/-)的细胞系,DNA测序结果显示,HEK293细胞中sABHD16A被成功敲除。5、为了探究sIFITM1和sABHD16A的相互作用对JEV感染的影响,sIFITM1和sABHD16A表达质粒共转染BHK-21细胞,结果显示共表达两种蛋白时的抗病毒作用明显强于单独表达IFITM1,说明sABHD16A具有协同sIFITM1抗JEV作用。6、为了研究sIFITM1抗JEV作用是否与sIFITM1的S-棕榈酰化有关,构建了S-棕榈酰化位点突变体表达质粒▲sIFITM1(sIFITM1-C50A-C51A-C84A),转染PK15细胞,与转染sIFITM1、sABHD16A、共转sIFITM1/sABHD16A相比,转染▲sIFITM1时,对JEV的抑制明显减弱,共转染▲sIFITM1/sIFITM1时的协同抗JEV活性也明显降低。该结果初步证明sIFITM1的抗JEV作用与其棕榈酰化有关,而该位点的棕榈酰化可能与sABHD16A有关。7、为明确sIFITM与sABHD16A是否参与调控JEV,通过荧光定量PCR检测过表达sIFITM1或sABHD16A的细胞中炎症相关因子的表达水平,结果显示IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α和COX2的mRNA水平均显著升高。但共表达sIFITM1/sABHD16A时,除了COX2之外,这些细胞因子的mRNA表达水平显著降低。JEV感染过表达sABHD16A的细胞时,IL-1β,IL-6和TNF-α表达水平显著上升,而JEV感染共表达sIFITM1/sABHD16A的细胞时,与其对照组和其他感染细胞相比,炎症因子表达水平则有所下降,说明sIFITM1在调节炎症平衡方面可发挥重要作用。本研究所取得的结果,不仅为后续研究开展提供了一系列实验材料,也为乙型脑炎的预防和治疗提供了理论支持。
【图文】：

图 1-1：日本脑炎的地理分布re1-1: Geographic distribution of Japanese encephalitis（Travelers' Health: Yellow Book of Specific Infectious Diseases, Japanese Encephalitis, Map 4-06 Geographic distributioencephalitis）

图 1-2：JEV 基因组结构和基因表达A：基因组结构。正链基因组 RNA 在 5'-3'方向含有帽子结构，，5'NCR，长 ORF 和 3'NCR。B：基因表达(引自 Yun S I, Lee Y M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines[10])Figure 1-2: JEV genome structure and gene expression.A: Genome structure. Positive strand genomic RNA contains a cap structure in the 5'-3' direction, a 5' NCR, a lo
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.21

【参考文献】

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本文编号：2614163