新型HER2嵌合抗原受体的构建与CAR-NK细胞体外杀伤活性研究

发布时间：2020-04-06 12:02

【摘要】：HER2蛋白属于EGFR家族,可通过同源二聚体偶联,激活信号转导通路,导致基因转录的上调,这些基因会促进肿瘤的发生与发展。HER2在乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面高表达,且HER2阳性乳腺癌恶性程度高,预后差,因此HER2被认为是抗肿瘤治疗的重要靶点。亲和体(Affibody)是一种经人工筛选改造后的新型支架蛋白,由于其与抗原的结合类似抗原-抗体结合,因此有“人工抗体”之名。亲合体分子量小,特异性强,亲和力高,通常被用作生物成像的分子探针,或肿瘤治疗性药物的载体。近年来,肿瘤免疫治疗成为了抗肿瘤研究领域的热点之一。其中,嵌合抗原受体修饰NK细胞(CAR-NK)的免疫治疗技术,作为一种新型抗肿瘤免疫疗法被广泛关注。本文的创新点在于构建了以可特异性识别并结合HER2的亲合体Z_(HER2)作为嵌合抗原受体胞外结构域的质粒(Z_(HER2)-28ζ-pLVX-Puro),据我们所知,这是首次将亲合体作为CAR胞外区。除此以外,本研究还构建了1种以anti-HER2的人源化scFv为胞外区的第二代嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞。我们首先在体外构建了3种重组anti-HER2的慢病毒表达质粒。其次,我们利用293TX细胞包装了慢病毒颗粒并测定了滴度,然后利用超滤离心管或超速离心法浓缩了慢病毒颗粒。在转染293TX细胞并进行嘌呤霉素筛选之后,在蛋白水平上,Western Blot实验证明3种CAR蛋白的表达;而在细胞水平,利用免疫荧光和荧光成像评估CAR结构的表达。此外,我们利用anti-HER2 scFv-28ζCAR慢病毒颗粒转染NK-92MI细胞系,并利用嘌呤霉素对CAR-NK细胞进行筛选,随后用荧光成像验证CAR结构的表达,最后利用LDH释放实验评估其对HER2高表达乳腺癌细胞系的特异性细胞毒性,为anti-HER2 CAR-NK治疗乳腺癌提供实验基础。
【图文】：

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可通过同源二聚体的偶联激活信号转导通路，从而导致一些特定基因的转录上调，这些基因可以驱动细胞的增殖、迁移、分化和血管生成，并抑制细胞凋亡，促进细胞的存活[3]。HER2 蛋白在多种肿瘤细胞表面高表达，如：乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、胃癌[6]、胶质瘤[7]等，且与不良预后正相关，因此 HER2 蛋白被认为是抗肿瘤治疗的重要靶点。1.1.2 乳腺癌发病情况简介在中国，癌症是导致死亡的主要原因[8]。据统计，中国女性新发病例排名第一的癌症是乳腺癌，其后是肺癌和结直肠癌等[9]（见图 1-1）。近 10 年来，女性乳腺癌的发病率显著呈现出攀升的趋势[10]，15~44 岁的女性群体是乳腺癌的高发人群[9]（见图 1-1）；而从地域上讲，城市女性罹患乳腺癌的概率高于乡村女性[9]，，这可能与经济社会发展之后，肥胖人群的比例增加[11]，以及城市女性压力大有关。Picon-Ruiz 等[12]报道了肥胖会导致促炎性因子在人体局部和体液循环当中促进肿瘤血管生成，并刺激大多数恶性肿瘤干细胞（CSC）群，驱动肿瘤生长、侵袭和转移的研究。

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与其他亚型相比，HER2 阳性乳腺癌表现为侵袭性更强，患者总生存期更短[14]。基于 Slamon 等[15]的研究结果，针对 HER2 的人源化单克隆抗体（mAb）曲妥珠单抗被批准单独或与化疗联合使用以治疗乳腺癌，同时，这也是第一种被批准用于治疗乳腺癌的生物制剂，显示出罹患早期 HER2 阳性乳腺癌的患者化疗后无病生存期（DFS）的改善。除曲妥珠单抗外，目前常用的治疗 HER2 阳性乳腺癌的药物包括：帕妥珠单抗[16]、小分子酪氨酸酶抑制剂拉帕替尼[17]以及抗体-微管抑制剂缀合物Ado-trastuzumab emtansine（T-DM1）[18]等。1.2 自然杀伤细胞简介自然杀伤（NK）细胞是具有高抗肿瘤、抗病毒和抗微生物活性的先天性免疫系统的细胞，其杀伤肿瘤细胞的途径主要包括：细胞毒作用、细胞因子的释放、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）以及遗传修饰（例如嵌合抗原受体修饰），如图 1-2[19]所示。
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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