肠道微生物产生的内毒素增加心管不融合发生率的机制研究

发布时间：2020-04-08 12:48

【摘要】：目的存在于细菌细胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)可以诱导细胞毒性和炎症相关的反应。然而,在产前胎儿中LPS参与诱导的心脏畸形的机制仍然是未知的。本课题利用早期鸡胚为模型,探索LPS影响胚胎早期心管发育的细胞及其分子机制。方法首先对人及老鼠肠道菌群紊乱后内毒素水平进行检测,利用鸡胚LPS处理后,HH10期观察其心管发育情况;其次在HH7、HH10期取材,利用免疫荧光、原位杂交、Q-PCR、Western blot、电穿孔转染-移植等方法,观察LPS环境下胚胎早期心管发育中关键转录因子的表达,心肌细胞迁移、分化情况,心肌细胞的增殖凋亡情况及ROS水平等的改变,探索LPS对心管发育的影响机制。并结合体外原代培养及H9c2细胞培养探索LPS诱导ROS水平升高参与心管畸形的机制。结果我们发现在肠道菌群紊乱的孕妇体内内毒素水平有升高趋势。随即,我们又在肠道菌群紊乱的小鼠身上得到进一步验证。在鸡胚HH10时期,LPS暴露增加了心管不融合的发生率。基因转染和组织移植的迁移轨迹表明,LPS暴露限制了心脏祖细胞向两侧生心区的细胞迁移。体外培养的心脏前体细胞表明LPS可以抑制细胞向周围迁移。从细胞划痕实验中也得到了类似的观察结果,即使H9c2细胞暴露于LPS中培养。在暴露于LPS的胚胎中,Nkx2.5和GATA5的表达受到干扰,当心管融合发生时,这些基因与心肌细胞分化相关。另外,pHIS3、ccaspase3免疫组织学染色表明,在鸡胚的早期心管中,细胞增殖减少,细胞凋亡增多。在体外细胞实验中,细胞流式凋亡检测,pHIS3免疫组织染色和Hochest/PI染色得出类似的结论。LPS暴露也导致了过量ROS的产生,这可能会损害发育中的胚胎的心脏前体细胞。最后,通过添加抗氧化剂,可以部分逆转LPS诱导的心管不融合。结论总之,这些结果表明,在鸡胚发育过程中,LPS诱导的心管不融合与过量的ROS产生相关。
【图文】：

LPS组成

心管,鸡胚,发育过程

南大学硕士学位论文肠道微生物产生的内毒素增加心管不融合发生率的机制研究 HH4 期的原条开始出现第一生心区的细胞，在 HH5-HH6 期时，这些细胞迁到头部两侧的脏壁中胚层，，这两部分被称为心脏新月体，而心脏新月体会发育线性心管[25]。在 HH7 阶段，心脏前体细胞开始从脏壁中胚层分离，通过 EMT程和迁移形成双边性心管，此后不久，心管开始融合，在 HH10 期，心管开始动[26]（图 2）。在鼠胚发育过程中的 E7.0 天，心脏前体细胞开始向前外侧方迁移形成一个新月，新月包含两种类型的祖细胞:第一生心区(first heart fields，HF)和第二生心区(second heart fields，SHF)。在 E8.0 天, 来自第一生心区的心前体细胞融合在胚胎的中线,建筑原始心管[27]。此时，心脏的原基正式形成，着胚胎的发育，心管开始进一步分化形成心房，心室，心脏瓣膜等一系列结构，终形成复杂的心脏。人类早期心管的发生与鸡胚大致相似。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

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