白藜芦醇体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞突触可塑性的研究

发布时间：2020-04-09 12:01

【摘要】：目的:从脐带组织中提取并纯化人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),进行实验室培养,观察并记录其形态变化及生长情况;流式细胞术进行表型分析;探索在不同浓度的白藜芦醇(Resveratrol)定向诱导人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的作用与效率;观察诱导后神经样细胞的形态变化,检测突触标记物基因与蛋白表达水平,探索诱导后神经样细胞的突触可塑性,为hUC-MSCs体内移植参与临床治疗中枢神经系统损伤等疾病提供理论支持。方法:采用酶消法从脐带组织中获取原代hUC-MSCs。流式细胞术检测hUC-MSCs表型。取P3代hUC-MSCs,随机分为A、B、C、D四组,A、B、C、D组先加入预诱导液(含50ng/mL bFGF的Neurobasal medium)预诱导24小时,然后A、B、C组分别加入白藜芦醇浓度为5mg/L/、10mg/L、20mg/L的诱导液诱导1天,然后更换维持液继续培养至7天,诱导液用Neurobasal medium配制,维持液用含2%B27、50ng/mL bFGF的Neurobasal medium配制。D组诱导时只加Neurobasal medium培养基诱导1天,再用含2%B27、50ng/mL bFGF的Neurobasal medium培养至7天作为对照。倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化,分别在诱导后的第1、2、3、4、5、6、7天每组随机选取10个无重叠视野,采集图像并统计视野内神经样细胞的百分比;免疫荧光染色检测突触素(synaptophysin,SYN)、生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)、突触后致密物95(postsynaptic denstity protein 95,PSD95)的阳性表达率,继而选取诱导效果较为理想的一组,分别于诱导的第0、1、2、3、4、5、6天提取细胞总RNA及蛋白,用RT-PCR、Western Blot方法检测SYN、GAP43、PSD95的表达情况。结果:1.流式细胞术检测P2、P8代细胞表型结果:表达CD105、CD90、CD73;不表达CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR(MHC-Ⅱ)。2.免疫荧光染色检测SYN、GAP43、PSD95表达的阳性率,A、B、C、D四组SYN的阳性率依次为0%、3.24±1.40%、49.32±2.85%、0%;GAP43的阳性率依次为0%、3.16±1.42%、5.62±2.41%、0%;PSD95的阳性率依次为0%、2.88±1.60%、41.75±2.08%、0%。结果显示三种突触标记物的阳性率均是C组最高,与其它各组相比有显著差异(P0.01),因而选取C组细胞继续做RT-PCR、Western Blot实验。3.RT-PCR检测C组细胞在诱导0、1、2、3、4、5、6天后SYN、GAP43、PSD95 mRNA的相对转录水平,SYN的相对转录水平依次为0.386±0.026、0.446±0.011、0.462±0.014、0.515±0.016、0.523±0.029、0.558±0.028、0.516±0.034;PSD95的相对转录水平依次为0.055±0.013、0.170±0.017、0.265±0.018、0.290±0.016、0.327±0.023、0.291±0.020、0.269±0.020;GAP43的相对转录水平依次为0.082±0.018、0.112±0.014、0.119±0.012、0.124±0.017、0.399±0.020、0.559±0.017、0.387±0.019。结果显示三种标记物诱导后各时间组均与空白组有显著差异(P0.01)。4.Western Blot检测C组细胞在诱导0、1、2、3、4、5、6天后SYN、GAP43、PSD95的蛋白相对表达量,SYN的相对表达量依次为0.185±0.017、0.346±0.027、0.535±0.035、0.598±0.026、0.678±0.037、0.657±0.031、0.585±0.034;GAP43的相对表达量依次为0.188±0.015、0.314±0.038、0.386±0.032、0.582±0.035、0.679±0.037、0.458±0.043、0.368±0.029;PSD95的蛋白相对表达量依次为0.065±0.020、0.303±0.036、0.397±0.032、0.497±0.041、0.649±0.053、0.489±0.060、0.263±0.025。诱导后各时间组相比空白组均有显著差异(P0.01)。结论:1.从脐带间质中可成功分离纯化hUC-MSCs,并能在实验室培养环境下稳定生长及传代。2.所得hUC-MSCs造血干细胞表面标记物CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR(MHC-Ⅱ)表达呈阴性;间充质干细胞表面标记物CD105、CD90、CD73表达呈阳性。3.20mg/L的白藜芦醇可有效地将hUC-MSCs体外诱导分化为神经样细胞,并形成突触样结构,表达突触标记物SYN、GAP43、PSD95。4.hUC-MSCs经诱导后具有形成突触的物质基础,为进一步的细胞电生理实验提供了理论支持。5.hUC-MSCs拥有向神经细胞分化的能力,可以作为神经系统疾病干细胞移植治疗的细胞来源。
【图文】：

集落,细胞,原代培养

hUC-MSCs原代培养2天，细胞呈集落状生长（40×）

指纹,原代培养,集落,细胞

图 1 hUC-MSCs 原代培养 2 天，细胞呈集落状生长（40×）g.1 Primary hUC-MSCs were cultured for 2 days, and the cells wcolony-shaped
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】