鲍曼不动杆菌三种重组表达蛋白的免疫原性和免疫保护性研究

发布时间：2020-04-10 18:53

【摘要】：目的:通过原核重组表达获得鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)重组蛋白OmpK、Omp22及Omp K/Omp22融合蛋白,动物免疫接种后检测并比较分析其免疫原性和免疫保护性,探讨构建鲍曼不动杆菌基因重组亚单位疫苗的新策略。方法:1.采用PCR的方法以鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606基因组DNA为模板扩增OmpK、Omp22基因,并通过重叠延伸PCR获得OmpK/Omp22融合基因,将OmpK、Omp22基因及OmpK/Omp22融合基因分别克隆入pColdI质粒载体,对筛选到的重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。将重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)株,重组菌经异丙基硫代半乳糖苷诱导后,镍亲和柱纯化重组蛋白。2.分别将3种重组蛋白各20μg(溶于PBS缓冲液50μL)与等体积弗氏佐剂混合后作为抗原免疫接种Balb/c小鼠,并于初次免疫后第14、21天以相同剂量重组蛋白与弗氏佐剂混合后各加强免疫一次,设置PBS对照组(即只给每只动物注射PBS溶液50μL和等体积弗氏佐剂)。于末次免疫后第7、21天小鼠内眦取血,酶联免疫吸附试验测定抗血清效价。3.末次免疫后第3周分离小鼠脾淋巴细胞,体外经相应抗原刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA法测定IFN-γ细胞因子释放水平。4.末次免疫3周后以鲍曼不动杆菌临床分离株攻击免疫小鼠,记录小鼠存活率,采集小鼠外周血检测其细菌载量,分离小鼠肺组织HE染色后观察其病理变化。结果:成功构建了3个重组质粒pColdI-OmpK/Omp22、pColdI-OmpK、pColdI-Omp22,转化大肠杆菌BL21(DE3)株后经IPTG诱导可表达分子量与理论值一致的3个重组蛋白OmpK/Omp22、OmpK、Omp22,纯化的重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清均具有特异性,末次免疫后的第7、21天融合蛋白OmpK/Omp22免疫组小鼠血清抗体滴度明显高于Omp K免疫组及Omp22免疫组(P0.05)。Omp K/Omp22免疫组小鼠的脾淋巴细胞经相应抗原再次刺激后的淋巴细胞增殖率明显高于OmpK免疫组及Omp22免疫组(P0.05)。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ产量分别为:0.521±0.069ng/mL,0.48±0.042ng/mL,0.485±0.050ng/mL均高于PBS对照组(0.423±0.1088ng/mL)。PBS对照组小鼠受到鲍曼不动杆菌临床分离菌株攻击感染后72h内全部死亡,而直至攻击感染后第8天OmpK/Omp22、Omp K、Omp22免疫组小鼠存活率分别为66.7%,25%,37.5%。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠外周血细菌载量均低于PBS对照组(P0.05),而OmpK/Omp22融合蛋白组细菌载量最低(P0.01)。肺组织HE染色结果显示PBS对照组肺组织存在严重的间质性肺炎改变,其血管周围可见大量炎性细胞浸润,OmpK和Omp22免疫小鼠的肺组织出现中等度肺炎改变及中等度的炎性细胞浸润,而Omp K/Omp22融合蛋白免疫组小鼠肺组织仅表现为轻度的炎症反应和极少量炎性细胞浸润。结论:3种重组蛋白小鼠免疫接种后均表现出较强的免疫原性和一定程度的免疫保护性,融合蛋白OmpK/Omp22的免疫原性和免疫保护性明显强于单个重组蛋白OmpK及Omp22。该研究结果可为进一步优化鲍曼不动杆菌亚单位疫苗分子设计以及构建包含多个抗原组分的多亚单位疫苗等研究提供参考依据。
【图文】：

融合基因,鲍曼不动杆菌,基因,琼脂糖凝胶电泳

曼不动杆菌 OmpK、Omp22 基因及 OmpK/Omp22 融合PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（DL2000）；1：OmpK 基因 PCR 扩增产物；2：Omp22 融合基因的 PCR 扩增产物菌 OmpK、Omp22 及 OmpK/Omp22 基因mp22 基因及 OmpK/Omp22 融合基因经 B与经 BamHⅠ/SalⅠ双酶切的载体进行连接随机挑取阳性克隆提取质粒，筛选到分子量组质粒，，分别命名为 pColdI-OmpK/Omp22、，3 种重组质粒经限制性内切酶消化后进行Omp22 经 BamH I 和 SalⅠ双酶切后释放 pK 经 BamH I 和 SalⅠ双酶切后释放 750b

重组表达质粒,酶切鉴定,图谱,重组质粒

图 2 重组表达质粒 pColdI-OmpK 的酶切鉴定图谱分子量标准(λDNA EcoRⅠ/HindⅢ); 1：质粒 pColdI; 2:重组质粒 pColdI-OmpK; 3 经 BamHⅠ单酶切分析; 4: 重组质粒 pColdI-OmpK 经 BamHⅠ单酶切分析；5：重-OmpK 的 BamHⅠ/SalⅠ双酶切分析
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】