IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究

发布时间：2020-04-10 19:28

【摘要】：研究目的本实验利用BALB/c小鼠的调节性T细胞(Treg),研究在不同剂量、不同时间IL-15作用下,细胞发生自噬的情况以及免疫功能的变化。明确IL-15对Treg自噬作用和免疫功能影响。进一步利用IL-15、自噬抑制剂SBI-0206965或自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)处理细胞,探索IL-15通过调节Treg细胞自噬影响其功能的相关分子机制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾脏,通过MiniMACs免疫磁性分离系统从单个核细胞中分离CD4~+CD25~+Treg细胞和CD4~+CD25~-T细胞(效应性T细胞,Teff)。利用流式细胞技术对细胞进行纯度鉴定和活力检测。2、IL-15对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响:将分离出的Treg细胞计数,以2×10~5个/孔接种于96孔板。按照IL-15浓度分为10ng/ml组、25ng/ml组、50ng/ml组和100ng/ml组;按照培养时间分组,分为12h组、24h组、48h组和72h组。分别给予相应剂量和IL-15处理相应时间,置于37℃、5%CO_2培养箱静置培养。分别收集细胞后,采用流式细胞术检测Foxp3和CTLA-4表达水平。3、IL-15对Treg细胞自噬的相关分子LC3的影响:选取IL-15对Treg细胞活化影响的最佳剂量和时间条件。将分离出的Treg细胞计数,以2×10~5个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组:Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、Rap组、IL-15+Rap组。此外,为模拟脓毒症体外环境加入LPS,进行同样的分组。分别给予相应的试剂处理后,对细胞进行免疫荧光染色,共聚焦观察LC3的表达,研究Treg细胞内自噬体的形成情况。并收集细胞,利用流式细胞术检测LC3分子表达水平。4、IL-15和细胞自噬对Treg细胞相关分子Foxp3和CTLA-4表达的影响:将分离出的Treg细胞计数,以2×10~5个/孔接种于96孔板。对细胞进行分组:Control组、IL-15组、SBI组、IL-15+SBI组、Rap组、IL-15+Rap组。此外,为模拟脓毒症体外环境加入LPS,进行同样的分组。收集细胞后,Foxp3和CTLA-4分子进行流式细胞术检测其表达水平。5、IL-15对Treg细胞免疫功能的影响:采用ELISA法检测各个分组上清液中IL-10和TGF-β水平的变化。并将Treg和Teff进行共培养后,检测上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究结果1、按上述步骤从BALB/c小鼠单个核细胞中分选出CD4~+CD25~+Treg细胞后检测其纯度达到92%以上,Teff细胞的纯度为95%,苔盼蓝检测到CD4~+CD25~+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在剂量为100ng/ml处理48h的条件下,Treg细胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表达水平显著增加(P0.01),在此情况下,IL-15对Treg细胞刺激最为明显。因此选定该条件处理后续实验。3、共聚焦显微镜观察免疫荧光和流式细胞术分析结果均显示,相较于Control组,IL-15组和SBI组LC3分子表达水平显著减少,IL-15+SBI组明显增加(P0.05),Rap组和IL-15+Rap组显著上调(P0.01)。在LPS刺激Treg细胞条件下,较Control组,IL-15组和SBI组的LC3分子表达水平显著下调,IL-15+SBI组明显增加(P0.05),Rap组和IL-15+Rap组显著增强(P0.01)。4、流式细胞分析结果显示:相较于Control组,IL-15组和IL-15+Rap组细胞Foxp3表达显著上调(P0.01),IL-15+SBI组和Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达均有增加(P0.05)。在LPS刺激Treg细胞条件下,IL-15+Rap组细胞Foxp3和CTLA-4表达水平在比Control组显著增多(P0.01)。5、采用ELISA技术检测各个组细胞培养上清液中细胞因子分泌水平,结果证实加入IL-15处理后,IL-10和TGF-β水平均有明显上升(P0.01)。在与Teff共培养后,IL-15组细胞分泌IFN-γ/IL-4比值较Control组有所下降,Teff具有向Th2极化的趋势。结论:100ng/ml IL-15在处理Treg细胞48h后,可明显诱导细胞表达相关分子Foxp3和CLTA-4,并诱导细胞自噬的发生。IL-15通过CD4~+CD25~+Treg自噬介导其活化并发挥免疫抑制功能。
【图文】：

加 1ml 1x 破膜剂缓冲液洗涤，，1100r/min，离心聚甲醛将其固定，流式细胞仪对其进行检测。统计学处理实验结果PSS19.0 统计分析软件对实验数据进行分析，所有计量（x± s），组间差异采用单因素方差分析进行比较，两验，当 P<0.05 时，差异被认为具有统计学意义。果ALB/c 小鼠脾脏分离 CD4+CD25+Treg 细胞的纯度测定LB/c 小鼠脾脏单个核细胞分选出 CD4+CD25+Treg 细CD4+CD25-Teff 的纯度为 95%（见图 1），苔盼蓝检测在 94%以上。a b

加 1ml 1x 破膜剂缓冲液洗涤，1100r/min，离心聚甲醛将其固定，流式细胞仪对其进行检测。统计学处理实验结果PSS19.0 统计分析软件对实验数据进行分析，所有计量（x± s），组间差异采用单因素方差分析进行比较，两验，当 P<0.05 时，差异被认为具有统计学意义。果ALB/c 小鼠脾脏分离 CD4+CD25+Treg 细胞的纯度测定LB/c 小鼠脾脏单个核细胞分选出 CD4+CD25+Treg 细CD4+CD25-Teff 的纯度为 95%（见图 1），苔盼蓝检测在 94%以上。a b
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 路帆;刘万林;;细胞自噬在激素性股骨头缺血性坏死的作用[J];世界最新医学信息文摘;2017年92期

2 暴苗;赵艳红;周晋;;细胞自噬在血液系统恶性疾病中作用研究进展[J];中华实用诊断与治疗杂志;2018年05期

3 赵书毅;;细胞自噬机制,不可或缺的细胞质量控制系统——2016年诺贝尔生理学或医学奖解读[J];中学生物学;2016年11期

4 吴劲松;;细胞自噬摭谈[J];生物学教学;2017年04期

5 苏杜林;王健;;对2016年诺贝尔生理学或医学奖的解读与讨论[J];中学生物教学;2017年07期

6 韩翠翠;;细胞自噬及相关试题分析[J];中学生物教学;2017年09期

7 奇云;;细胞自噬机制研究缘何摘得诺奖?——2016年诺贝尔生理学或医学奖解读[J];生命世界;2016年12期

8 王海杰;谭玉珍;;细胞自噬机制开启疾病治疗新途径[J];解剖学报;2017年01期

9 林承列;李江;周宜;孙艳红;王丽华;胡钧;樊春海;;基于细胞自噬机制的健康科学研究进展[J];核技术;2017年02期

10 贾静文;;细胞自噬的研究进展[J];山西农经;2017年03期

相关会议论文 前10条

1 许赤;陈文捷;杨杨;李华;易述红;陈规划;;老年大鼠肝脏细胞自噬及其移植后改变[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年

2 刘杰民;纪云西;蒋历;黄贵华;郑超伟;郭超峰;;细胞自噬是探索中医药微观机制的新思路[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十四次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2012年

3 杨键;邓玉杰;张晓燕;吕鹏飞;徐俊;杨颖;宁光;;脂肪细胞自噬检测方法的建立及意义探讨[A];中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议论文集[C];2012年

4 赵琳娜;林德贵;;细胞自噬的分子机制[A];第六届西部宠物医师大会论文集[C];2017年

5 陈宁;;运动干预对健康促进的分子生理机制:从细胞自噬角度的阐释[A];2018年中国生理学会运动生理学专业委员会会议暨“科技创新与运动生理学”学术研讨会论文集[C];2018年

6 代重山;汤树生;肖希龙;;细胞自噬调控分子机制最新研究进展[A];中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会会议论文集[C];2017年

7 夏福灿;郭振红;姜岩岩;邓常文;屈玉兰;邓捷文;蔡志坚;曹雪涛;王建莉;;B细胞自噬在过敏性哮喘发生发展中的作用及调节机制研究[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年

8 殷帆;陆利民;;细胞自噬在肾小管损伤机制中的研究进展[A];庆祝中国生理学会《生理学报》创刊90周年专辑[C];2017年

9 李康生;代剑平;;病毒感染与细胞自噬[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年

10 杨键;邓玉杰;张晓燕;吕鹏飞;徐俊;杨颖;宁光;;脂肪细胞自噬检测方法的建立及意义探讨[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 张梦然;细胞自噬关键蛋白突变可延寿[N];科技日报;2018年

2 记者 刘海英;美找到刺激细胞自噬新策略[N];科技日报;2018年

3 记者 严粒粒;细胞自噬与多种疾病密切相关[N];浙江日报;2016年

4 记者白毅;介入细胞自噬过程可减轻缺血性脑损伤[N];中国医药报;2009年

5 记者 张建琛 通讯员 李静;我科学家发现细胞自噬密码[N];科技日报;2012年

6 ;细胞自噬的奥秘被发现[N];农村医药报（汉）;2007年

7 小亦;日发现细胞自噬奥秘[N];中国医药报;2007年

8 常丽君;英发现控制细胞自噬过程分子开关[N];科技日报;2012年

9 记者 钱铮;细胞自噬作用有“油门”“刹车”[N];新华每日电讯;2009年

10 首席记者 唐闻佳;日本科学家凭细胞自噬研究摘诺奖[N];文汇报;2016年

相关博士学位论文 前10条

1 冯艳玲;细胞自噬相关蛋白Atg7抑制PKM2磷酸化参与Warburg效应调节影响细胞上皮间质转化[D];中国医科大学;2018年

2 周正杰;调控细胞自噬以及组织穿透性增强肿瘤光热治疗的研究[D];华东师范大学;2018年

3 杨萌;γb蛋白抑制细胞自噬和活性氧迸发促进大麦条纹花叶病毒侵染的分子机制研究[D];中国农业大学;2018年

4 蒋鹏娜;基于PI3K/Akt信号通路探讨平喘颗粒干预气道上皮细胞自噬与凋亡的机制[D];黑龙江中医药大学;2018年

5 康成容;PI3K/Akt/mTOR介导的细胞自噬在钽颗粒促成骨细胞增殖中的作用研究[D];南方医科大学;2018年

6 张梅;miR-337及细胞自噬相关基因LC3B、p62、p53在人视网膜母细胞瘤中的功能和意义[D];安徽医科大学;2016年

7 王志勇;扶正祛邪方对APP/PS1 HEK293细胞自噬功能调节作用的研究[D];北京中医药大学;2017年

8 张青玉;姜黄素调控细胞自噬的分子机制研究及其在抗肿瘤治疗中的意义[D];南京大学;2016年

9 徐晓恒;增殖细胞核抗原胞质表达对乳腺癌细胞自噬调控作用的研究[D];吉林大学;2015年

10 马特安;高糖诱导的足细胞自噬及其机制[D];武汉大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 李佳;IL-15对调节性T细胞自噬作用影响的研究[D];广西师范大学;2018年

2 张P";细胞自噬在猪细小病毒复制过程中的作用[D];西北农林科技大学;2018年

3 张珊姗;细胞周期检验点激酶2磷酸化Beclin 1在细胞自噬中的作用及其机制研究[D];中国医科大学;2018年

4 裴永霞;铅胁迫诱导日本三角涡虫细胞自噬机制研究[D];陕西师范大学;2018年

5 苏晶晶;PHEV病毒蛋白PLP诱导N2a细胞自噬作用的研究[D];吉林大学;2018年

6 曲园园;河北省Ⅱ型汉坦病毒流行特征及与细胞自噬相互作用研究[D];河北医科大学;2018年

7 卫新荣;TGF-β_1对宫颈癌SiHa细胞自噬关键基因Beclin1影响的研究[D];山西医科大学;2018年

8 于宁;HVJ-E诱导Hela细胞自噬的途径及作用机制[D];扬州大学;2018年

9 阚先进;猪流行性腹泻病毒诱导细胞自噬的分子机制[D];扬州大学;2018年

10 薛圣杰;家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬及凋亡的调控机制研究[D];浙江理工大学;2018年

本文编号：2622625