自吞噬机制在iPS细胞干预猪心肌梗死动物模型中的作用探讨

发布时间：2020-04-11 03:20

【摘要】：背景:心血管疾病,尤其是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI),严重影响病人的生活质量,是发达国家的首位死亡原因,也是发展中国家疾病负担的主要原因之一。近年来有较多关于干细胞(Stem cell)移植对AMI有治疗作用的研究,主要包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)、骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)以及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)等。这些研究表明,干细胞移植可以改善AMI的心脏功能,并可能对缩小梗死后面积、减少心肌梗死的死亡率和致残率有一定的帮助。而其中,i PS细胞由于其具有类似ESC的全能性,却没有ESC的道德伦理争议,而且因为它来源于体细胞,避免了机体的免疫排斥反应,因此应用前景较为广阔。自吞噬(autophagy)是一种通过降解细胞质组件而自身进化的过程,以此来维持细胞的生存和组织内稳态。最近研究表明,自噬既可以使干细胞维持相对的未分化状态,又可以促进其分化过程。那么,自吞噬在i PS细胞移植干预AMI的过程中究竟起到何种作用,它是否可以作为i PS细胞移植作用于AMI的机制之一,目前尚未有相关研究。目的:探讨自吞噬在AMI猪模型进行i PSC移植后的可能作用,并进一步探讨其可能的作用机制。方法:1、建立AMI猪模型:选择幼年苏中猪20头,体重23.52±2.33 kg,随机分为3组:Sham正常对照组4头、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered solution PBS)对照组8头、i PSC移植组8头。对PBS组和i PSC移植组均采用介入法球囊堵闭猪冠状动脉的左前降支动脉(Left anterior descending artery,LAD),从而建立AMI模型。通过查心电图、检测血浆肌钙蛋白以及进行左心室造影来验证AMI动物模型构建是否成功。2、i PS细胞移植:在建立AMI模型前提前培养足够数量的猪源性i PS细胞。AMI模型建成后一周打开胸腔,对i PSC移植组幼猪随机注射猪源性i PS细胞2ml(含2x107个细胞)于梗死区(infaction zone,IZ)及梗死周边区(boder zone,BZ)心肌内,对PBS对照组幼猪以相同方法注射2ml PBS液体,而Sham正常组则仅置入导管及球囊,不封堵,一周后开胸,不进行任何干预措施后关胸。3、动物处死及标本的处理细胞移植后第七周处死动物,开胸取出心脏,将组织按梗死区IZ,梗死周围区BZ以及远离区RZ(remote zone)分别放入液氮中保存。进行TTC染色观察梗死心肌与正常心肌外观,HE染色观察心肌组织病理学改变。Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin1以及Cx43、MMP9、ANP等。结果:1、通过心电图改变及心室内造影提示猪急性心肌梗死模型建立成功。2、心脏标本的TTC染色提示i PS组心肌梗死面积明显小于PBS组(P=0.01);HE染色和Masson’Trichrom染色显示,在PBS组,梗死区呈连续性大片状纤维化,有较多炎性细胞浸润,未见存活心肌细胞。i PS组梗死区纤维化和炎性细胞浸润显著减轻,存活心肌较多,纤维化呈散在分布。i PS细胞移植组梗死周围区域纤维组织显著低于PBS组(P0.05)。3、自吞噬标志物的检测:PBS组梗死区IZ、梗死周围区BZ相对于远离区RZ,LC3、Atg5及Beclin1的表达均显著增强;i PS组IZ相对于RZ的自噬表达明显增强;i PS组梗死区的自噬表达较PBS组梗死区有明显增强趋势,p值=0.058。4、PBS组中,心肌细胞的Cx43表达量在IZ及BZ明显低于RZ,其中,IZ与RZ相比有统计学差异(P0.05);在i PS组中,心肌细胞的Cx43表达量在IZ及BZ亦明显低于RZ,且有统计学差异(P0.05);i PS组IZ的Cx43表达量较PBS组IZ有明显增强趋势(P0.05)。5、PBS组中,IZ与RZ相比,心肌细胞的MMP9的表达显著增高,有统计学差异(P0.05);在i PS组中,心肌细胞的MMP9表达量在IZ及BZ却较RZ为低,但并无统计学差异;i PS组IZ、BZ对比PBS组相同区域,MMP9的表达量均有显著降低(P0.05)。6、PBS组中心肌细胞的ANP表达量在IZ及BZ均明显高于RZ(P0.05);在i PS组中,心肌细胞的ANP表达量在IZ较BZ及RZ为低(P0.05);i PS组IZ对比PBS组IZ,ANP的表达量均有显著降低(P0.05)。结论:1、i PS干预AMI的过程中,可以引起自吞噬的上调;2、i PS可能通过自吞噬诱导心肌细胞Cx43的表达增加,从而可能对心脏电生理产生影响;3、i PS可能通过自吞噬诱导心肌细胞MMP9的表达减少,从而可能改善心肌重构;4、i PS细胞移植可以使心肌细胞内ANP的表达下调是否与自噬调节有关,有待进一步探索。
【图文】：

封堵,黑色,箭头

式注入稀释肝素 8000u，术中每隔 l 小时追加 2000u。2.1.3.7 左室造影及压力测定：接心电监护仪以监测心率及心律改变，术中给予低流量（3-5L/min）吸氧。经右股动脉鞘管送 6F 指引导管至左心室行高压注射造影。连接测压仪，调零后分别测定左室压力和主动脉压力。2.1.3.8 封堵冠状动脉 LAD：经鞘管逆行送入 Judkins Left 4.0 冠状动脉造至冠状动脉开口处行左冠状动脉造影，每次注入 5-20ml 优维显造影剂 370影。造影成功后，根据造影结果确定封堵位置。一般选 LAD 第一对角支以第二对角支以上，大约 LAD 中下 1/3 的位置为封堵位置。经指引导管送入导丝的球囊导管（2.0mm×l5mm），接近指引导管开口时先送导丝至 LAD 远再沿导丝送球囊导管至 LAD 封堵处，以 5-6 个大气压打开球囊，堵闭 LAD囊阻塞 90min 后撤掉大气压，血流通畅使前端的心肌得到血流灌注。球囊后往往容易出现再灌注心律失常，一般为室速、室颤，要在维持主动脉压定的同时随时做好静推利多卡因、电除颤的准备[1]。球囊封堵前后见图 1。

心电图,封堵,心电图变化,左心室造影

tachycardia， VT）、心室颤动（Ventricular fibrillation VF），尽管进行了电复治疗，仍未能抢救成功而在 90 分钟内死亡。故而，本研究总的死亡率为 25%值得注意的是一旦 iPS 细胞注入到心肌、关胸后，，没有一只猪死亡。1.2 鉴定猪急性心肌梗死模型是否成功：本研究采用心电图观察 ST 段抬高情况利用造模前后左心室造影观察室壁瘤形成、心室扩大情况来观察经 LAD 封堵建急性心肌梗死模型的效果。1.2.1 ECG 显示封堵 90 分钟后，V1-V3 导联 ST 段明显抬高（ >0.2mv），并病理性 Q 波形成（图 2）。1.2.2 封堵前，左心室造影（ Left ventricular angiography, LVG）显示左心室收协调一致，封堵 90 分钟后，左心室造影提示左室扩大、室壁瘤形成、收缩不一致（图 3）。以上结果表明：通过 LAD 封堵结扎成功建立了猪 AMI 模型。A B
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22;R-332

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