利用B细胞培养从人感染者筛选并获得H7N9高亲和力中和抗体

发布时间：2020-04-11 22:11

【摘要】：研究背景人感染H7N9禽流感病毒于2013年在我国首次分离,2016年10月在我国东南沿海地区再次出现,形成了第五次流行波。据世界卫生组织(WHO)数据显示,截至2017年12月,此次流行发病人数达767人,死亡报道292人,死亡率约38.1%。面对这种突发的新亚型流感病毒,至今缺乏有效的保护性疫苗。临床一线抗病毒药物早期虽能抑制病毒复制,但感染后期疗效不明显,且有报道临床已产生了耐药株。最近有研究分析表明病毒血凝素链接肽位置发生了插入性突变,使得H7N9从低致病性禽流感病毒(LPAIV)突变为高致病性禽流感病毒(HPAIV)。随着病毒的不断变异,有引起新一轮流感大流行的潜在可能。新的预防和治疗应对策略迫在眉睫。面对新突发的传染性疾病,抗病毒治疗依赖于从已有的药物中筛选或广谱抗病毒药物的研发。单克隆抗体可高效的中和病毒,发挥抗病毒作用。目前抗体筛选常用的技术有细胞杂交瘤技术、噬菌体展示技术、酵母表面展示技术、B细胞永生化技术和单细胞PCR技术。近年来随着单个B细胞抗体制备技术的成熟,其全人源、高效率、高特异性、抗体天然配对等优点,使其在抗体制备领域中被广泛应用,成为快速应对新突发传染性疾病重要手段。第一部分人感染H7N9病毒诱导宿主HA抗体产生的特异性及交叉反应研究目的探讨人感染H7N9宿主血清HA抗体的产生及与其他HA亚型的交叉反应特性,为广谱中和抗体的筛选及疫苗的研发提供依据。研究方法合成各亚型HA蛋白胞外域核苷酸序列,并克隆到改造过的pCDNA3.1载体上构建表达质粒。采用哺乳动物细胞表达体系表达C端带标签的H1,H3,H5和H7重组HA蛋白。用抗标签的抗体捕获293T细胞转染上清中的HA蛋白,建立ELISA法。用建立的ELISA法检测22例34份H7N9感染者血清抗体与蛋白H1、H3、H5、H7(2013)和H7(2017)的结合反应,同时设H1N1感染组及健康对照组。研究结果1.重组HA蛋白质粒的构建及蛋白表达成功构建了A/Shanghai/1/2013(H7N9)、A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)、H1N1、H3N2和H5N1病毒株HA蛋白表达质粒,经序列分析验证的质粒转染293T细胞表达HA重组蛋白,Western blot分析蛋白条带大约在72~100KD。2.血清抗体特异性和交叉反应22例34份H7N9感染血清对2013年的LPAI和2017年的HPAI H7N9禽流感病毒的HA蛋白均有显著结合(与健康对照组比较P0.01,与H1N1组比较P0.01)。同时血清抗体与组1的H1、H5(与健康对照组比较P0.01)及组2的H3有交叉反应(与健康对照组比较P0.05)。结论1.采用哺乳动物细胞表达体系成功表达流感病毒重组HA蛋白,并建立了可用于血清抗体检测的捕获ELISA法。2.人感染H7N9病毒可诱导机体产生特异的抗体反应,且对2013年LPAI分离株和2017年HPAI分离株均有结合反应。3.人感染H7N9病毒可诱导宿主产生与其他亚型HA蛋白(组1的H1、H5,组2的H3)的交叉反应,为广谱中和抗体的筛选及疫苗的研发提供了依据。第二部分人感染H7N9病毒HA特异的单克隆抗体的分离及特性鉴定研究目的从H7N9感染者体内筛选出抗HA的高亲和力中和性抗体,为流感疫苗的研制提供重要的靶点,同时为临床药物治疗提供可能的手段。研究方法分离H7N9感染者外周血单个核细胞,流式分选出记忆B细胞(IgD-IgM-CD27+CD38low),经培养后,采用捕获H7抗原ELISA法筛选B细胞培养上清的抗体分泌,收集阳性孔所对应的B细胞沉淀,应用单细胞PCR技术克隆抗体重、轻链可变区基因,分别连接到相应的重、轻链载体上,构建抗体重链和轻链表达质粒,并进行体外表达获得抗体。进而应用生物膜层干涉技术(BLI)检测抗体的亲和力;用建立的ELISA法检测抗体与蛋白H7(2013)、H7(2017)的结合反应;通过ELISA法检测抗体与HA蛋白截短片段(HA1、HA2和去球部HA)结合反应,结合抗体竞争抑制实验对抗体的抗原结合位点进行初步探索;并采用病毒微量中和实验检测抗体中和病毒的能力。研究结果1.抗体的分离和亲和力测定流式分选出的记忆B细胞经培养后,用捕获H7抗原ELISA法筛出12个阳性孔。收集阳性孔所对应的B细胞沉淀,提取RNA,逆转录合成cDNA,经2轮PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因,获得8对配对的轻链和重链目的条带,大小为350bp左右。产物经胶回收,分别连接到相应的重链和轻链载体上,最后成功构建5株抗体表达质粒,分别命名为:6C3、1-2、19B2、23B7、24D6。5株抗体与HA抗原均有很强结合活性,其亲和力(KD)在1nM~12nM之间。2.抗体的特异性与交叉反应5株抗体对2013年LPAI分离株和2017年HPAI分离株均有明显的结合;抗体6C3、19B2、23B7、24D6与蛋白H1、H3、H5无交叉反应;抗体1-2与组2的H3有交叉反应,而与组1的H1、H5无交叉反应。3.抗体与病毒HA结合位点的分析抗体6C3、19B2、23B7、24D6与HA、HA1有明显结合,而与HA2、去球部HA无结合;抗体1-2与HA、HA2、去球部HA有明显结合,而与HA1无结合。抗体竞争抑制实验结果显示,抗体1-2与抗体6C3、19B2、23B7、24D6无竞争;抗体6C3与抗体1-2无竞争,与抗体19B2、23B7、24D6竞争;抗体19B2与1-2、23B7、24D6无竞争,与抗体6C3竞争;抗体23B7与1-2、19B2无竞争,与抗体6C3、24D6竞争;抗体24D6与1-2、19B2无竞争,与抗体6C3、23B7竞争。4.抗体的中和活性病毒微量中和实验结果显示,抗体6C3、19B2、23B7、24D6对LPAI和HPAI H7N9禽流感病毒均有明显的中和活性(对LPAI株IC_(50)分别为0.05742、4.832、0.7157和2.051μg/ml;对HPAI株IC_(50)分别为0.2718、1.006、0.9995和3.442μg/ml),且对病毒的中和活性具有浓度依赖性,随着抗体浓度的增加,病毒感染率明显下降。结论1.应用B细胞培养技术,成功从H7N9感染者体内分离出5株HA特异的高亲和力单克隆抗体;2.获得的5株抗体对LPAI和HPAI株HA蛋白均有明显结合反应;3.抗体1-2与其他亚型HA蛋白有交叉结合,抗体6C3、19B2、23B7、24D6与其他亚型HA蛋白无结合;抗体1-2的结合部位可能位于HA茎部,抗体6C3、19B2、23B7、24D6很可能结合于HA头部,且抗体23B7、24D6结合位点相同,抗体6C3结合位点跨域最广;4.体外中和实验揭示抗体6C3、19B2、23B7、24D6对H7N9禽流感病毒LPAI和HPAI株均有明显中和活性,其中抗体6C3的中和活性最强,有望成为治疗性抗体的候选者。
【图文】：

图 1 HA 胞外域 PCR 产物电泳图g.1 The electrophoregram of PCR prodouSB/01/2009(H1N1)、A/Guangd和 A/Guangdong/HP001/2017(H7N经密码子优化后由通用生物公司载体 pcDNA3.1 上，经序列分析

图 3 H1N1、H3N2、H5N1 及 H7N9 重组 HA 蛋白 Western blysis of recombinant H1N1,H3N2,H5N1 and H7N9 HAproteins b特异性和交叉反应究 H7N9 禽流感病毒诱导宿主特异抗体的产生情况。SA 法首先检测分析 34 份人感染 H7N9 禽流感病毒患9 禽流感病毒和 2017 年 HPAI H7N9 禽流感病毒的 H
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2623897