蛋氨酸脑啡肽（MENK）对流感病毒PR8感染的免疫调节作用及机制的研究

发布时间：2020-04-12 13:51

【摘要】：目的:采用甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株PR8构建流感模型,通过MENK预防性和治疗性两种方式作用于感染流感病毒PR8的巨噬细胞RAW264.7体外实验,以及MENK作用于感染流感病毒PR8的小鼠体内实验,以Toll样受体为切入点探讨MENK体内外对流感病毒感染的免疫调节作用及调控机制,为MENK作为新型通用型流感疫苗(或疫苗佐剂)提供基础实验依据,为临床流感病毒的防治提供新策略。研究方法:1、MENK调控RAW264.7细胞抗流感病毒PR8感染。鸡胚培养对流感病毒PR8进行增毒,血凝试验(HA)检测病毒滴度,计算病毒TCID_(50)并以100TCID_(50)的病毒剂量感染RAW264.7细胞,通过MENK预防性和治疗性给药的方式进行干预。MTS检测MENK最佳作用浓度;光学显微镜和Hoechst染色观察细胞形态变化;流式细胞术检测RAW264.7细胞凋亡;流式细胞术检测RAW264.7细胞胞内Influenza NP和NF-κB p65的表达;细胞免疫荧光染色对细胞Influenza NP,NF-κB p65,MOR表达定位;q PCR法检测Virus、TLR4、TLR7、NF-κB p65、MOR mRNA水平。2、MENK调控感染流感病毒PR8小鼠固有免疫应答作用。采用6~8周C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组、流感病毒(PR8)模型对照组、MENK预防组,MENK治疗组,利巴韦林对照组。用10 LD_(50)病毒剂量感染小鼠,连续观察14天,记录小鼠体重及生存时间。于感染后第4天取材,对小鼠体内免疫相关指标进行检测。包括:肺组织的大体形态和肺HE染色;血凝试验(HA)测肺组织病毒滴度;组织免疫荧光法对肺组织Influenza-NP蛋白定位;q PCR检测肺组织IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-1β和Virus mRNA水平;Western blot、qPCR和免疫组织化学染色法检测阿片受体MOR、DOR,Toll受体通路相关因子TLR7、MyD88、TRAF6和NF-κB p65表达。3、MENK调控感染流感病毒PR8小鼠适应性免疫应答作用。采用6~8周C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组、流感病毒(PR8)模型对照组、MENK预防组,MENK治疗组。用2LD_(50)病毒剂量感染小鼠,于感染后第10天取支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结,制备单细胞悬液,流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结中CD4~+T、CD8~+T、CD4~+IFN-γ、CD8~+IFN-γ、CD4~+T_(EM)和CD8~+T_(EM)细胞,并用PMA/ionomycin,influenza NP(366-374),influenza PA(224-233)刺激支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结细胞,检测效应性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特异性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞。结果:1、MENK调控RAW264.7细胞抗流感病毒PR8感染的研究。流感病毒PR8经鸡胚分离培养后,病毒滴度由培养前的HA 1:32增加到1:512,100TCID_(50)/50μl=1:28.2。MENK 20~10~(-7)mg/ml均能促进RAW264.7细胞增殖,在浓度为10mg/ml、1mg/ml、10~(-1)mg/ml和10~(-2)mg/ml时与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05),且10mg/ml为最佳作用浓度。MENK预防组和MENK治疗组在感染病毒24h、48h、72h时,RAW264.7细胞凋亡减少。镜下显示PR8感染RAW264.7细胞后,形态由圆形、类圆形向不规则形转变,胞质内多有空泡和颗粒状物质出现。MENK预防和治疗组细胞呈长梭形且多伴伪足,偶有空泡和颗粒状物质出现。Hoechst染色显示正常组RAW264.7细胞的胞核呈暗蓝色,而PR8组出现大量凋亡细胞,胞核呈致密浓染、亮蓝色。MENK预防组和治疗组偶有或少量伴有细胞核呈碎点样浓染。流式细胞术、qPCR和免疫荧光染色显示MENK预防组和治疗组较比PR8组均能下调Influenza NP蛋白表达及上调NF-κB p65水平(P0.05)。RAW264.7细胞感染流感病毒48h后TLR4 mRNA表达量小幅上调(P0.05);MENK预防组和治疗组均能上调TLR4 mRNA水平(P0.05);四组细胞TLR7 mRNA表达量无明显变化(P0.05)。RAW264.7细胞在感染PR8后MOR mRNA的表达无明显变化(P0.05),MENK预防组和治疗组受体表达上调,显著高于正常对照组和病毒对照组(P0.01)。2、MENK调控感染流感病毒PR8小鼠固有免疫应答的研究。MENK预防性和治疗性给药能缓解PR8感染所致的小鼠体重降低,延长小鼠生存时间,且Pre-MENK组小鼠存活率高于MENK组。肺组织的大体形态和HE染色显示,PR8组肺组织出现广泛的组织实变和细支气管炎症、气道上皮坏死、炎性细胞浸润、弥漫性肺泡损伤伴水肿和出血;Pre-MENK组仅有轻微细支气管和肺泡炎性细胞浸润;Pre-MENK,MENK和Rib组与PR8组相比肺组织病理改变减轻,MENK组肺组织损伤程度(44.59%)高于Pre-MENK(23.22%)。血凝试验(HA)、q PCR、流感病毒NP免疫荧光强度结果显示,MENK预防性和治疗性给药可有效降低小鼠肺组织的病毒滴度,且预防性用药效果更明显。qPCR结果显示,MENK可显著降低IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达,减轻炎症介质失衡引起的肺组织病理损伤。MENK预防给药和治疗给药后小鼠肺组织阿片受体(MOR,DOR)上调,而PR8组和Rib治疗组与正常对照组比较受体表达量无明显变化(P0.05)。Western blot、qPCR和组化定位结果显示,PR8组TLR7,MyD88,TRAF6和NF-κB p65的表达水平明显升高,MENK预防性和治疗性给药均能降低其表达水平(P0.05)。3、MENK对感染流感病毒PR8小鼠适应性免疫应答的研究。Pre-MENK组支气管肺泡灌洗液和肺组织CD8~+T细胞比例较比PR8组明显升高(P0.05);MENK组肺组织中CD8~+T细胞比例较比PR8组增加(P0.05);Pre-MENK组和MENK组淋巴结CD4~+、CD8~+T细胞比例较比PR8组有不同程度的上调,但差异不显著(P0.05);Pre-MENK组支气管肺泡灌洗液和肺组织CD4~+IFN-γ、CD8~+IFN-γ细胞比例较比PR8组明显升高(P0.05),而MENK组支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结中各细胞虽有不同程度的增加,但未达到统计学差异(P0.05);Pre-MENK组支气管肺泡灌洗液和肺组织CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞比例及淋巴结中CD4~+T_(CM)、CD8~+T_(CM)比例较比PR8组呈现不同程度的上调(P0.01),而淋巴结CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞比例无明显变化(P0.05);MENK组支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结中CD4~+T_(CM)、CD8~+T_(CM)、CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞比例较比PR8组有所增加,但无统计学差异(P0.05);Pre-MENK组支气管肺泡灌洗液和肺组织效应性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特异性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞比例较PR8组显著增加(P0.01);MENK组支气管肺泡灌洗液、肺组织和淋巴结中效应性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特异性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)细胞比例与PR8组比较呈上升趋势,但未达统计学差异(P0.05)。结论:1、MENK通过上调阿片受体MOR,正向调控TLR4-NF-κB p65信号通路,增强RAW264.7细胞抗病毒效应。2、MENK通过下调TLR7-MyD88-NF-κB p65信号通路,抑制流感所致的过度免疫应答和急性肺损伤,预防性给药效果更明显。3、MENK能上调机体对病毒的特异性T细胞应答和针对病毒保守表位的免疫记忆。
【图文】：

3.1鸡胚培养PR8的滴度红细胞凝集试验（HA）结果显示流感病毒PR8经鸡胚分离培养后，病毒滴度由培养前的HA1:32增加到1:512。见图1.1。图1.1 鸡胚培养流感病毒后的病毒滴度Fig.1.1 Influenza virus titer by chicken embryo culture3.2流感病毒TCID50病毒组织细胞半数感染量（TCID50）是病毒感染能力的标化指标，根据Reed和Muench方法对HA进行计算，见图1.2、表1.2。100TCID50/50μl=1:28.2。

中国医科大学博士学位论文10图1.2 流感病毒TCID50（HA实验）Fig.1.2 Hemagglutination test detected influenza virus TCID50表 1.2 Reed-Muench 方法计算 TCID50滴度的病毒稀释度配比情况Tab.1.2 Dilution ratio of the virus TCID50using Reed-Muench method稀释度 阳性数目阴性数目阳性数 阴性数 比率阳性数百分比(%)10-24 0 11 0 11/11 10010-2.54 0 7 0 7/7 10010-33 1 3 1 3/4 7510-3.50 4 0 5 0/5 03.3MENK对RAW264.7最佳作用浓度不同浓度的MENK分别作用于RAW264.7细胞48h，MTS结果表明：MENK20～10-7mg/ml均能促进细胞增殖，在浓度为 10mg/ml 、1mg/ml、10-1mg/ml 和10-2mg/ml与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），，且在10mg/ml时到达峰值，之后随浓度的降低促进增殖作用减弱, 见图1.3(a)。采用对RAW264.7细胞增殖作用有统计学意义的MENK浓度作用于感染流感病毒PR8的细胞，MTS结果显示：随着病毒感染时间的延长，细胞增殖率降低（P＜0.05）；MENK预防组和MENK治疗组在感染病毒24h、48h、72h时，10mg/ml、1mg/ml均能提高细胞的增殖率
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965;R-332

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本文编号：2624790