肠道病毒71型感染对小鼠CPT2、PSGL-1和SCARB2的表达和作用的影响

发布时间：2020-04-17 12:43

【摘要】：第一部分肠道病毒71型感染对小鼠大脑与脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响目的：肉碱棕榈酰基转移酶(Carnitine palmitoyltransferase, CPT)系统在长链脂肪酸β-氧化中起着重要作用,也是线粒体脂肪酸氧化产生ATP的关键组成部分。长链脂肪酸进入线粒体的限速步骤是在线粒体外膜CPT1的催化作用下,通过转脂作用把脂肪酰辅酶A转变成酰基肉碱,并且在CPT1的作用下进入线粒体基质；在线粒体内膜CPT2把酰基肉碱转换成酰基辅酶A,然后进入β-氧化途径。在本实验中我们研究肠道病毒71型(Entero virus71, EV71)感染对小鼠大脑和脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响,探讨EV71相关脑炎的病理生理机制。方法：1日龄ICR小鼠8窝(48-80只),每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基O.1ml,观察小鼠感染后症状,并分别于病毒接种后5d、10d、15d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠和6只0d(未接种病毒前)小鼠,取出大脑、脑干。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量；电子显微镜检测线粒体；应用免疫组织化学(Immune histochemical, IHC)、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、脑干CPT2的表达；检测大脑和脑干细胞的CPT2酶活性和ATP水平。结果：EV71感染小鼠后5天,在大脑检测到EV71RNA拷贝数为5.334±0.30log1ocopies/mg tissue,脑干为6.20±0.19log10copies/mg tissue;然而,随着感染时间延长,EV71RNA拷贝数逐渐降低。在感染后5天,电镜显示线粒体肿胀、线粒体嵴和线粒体膜断裂、变短或消失；CPT2表达下降,CPT2酶活性减低；ATP水平明显下降；而在感染后的10-15天,这些变化逐渐恢复到正常状态。结论：我们的研究资料显示：EV71感染损伤了脑组织的线粒体,引起CPT2的表达减少,导致CPT2酶活性降低、ATP生成减少。能量代谢障碍可能加速或加重了EV71脑炎发展,可能与脑炎的严重程度相关。本研究从能量代谢障碍方面阐述了EV71脑炎的病理生理机制。第二部分PSGL-1在肠道病毒71型感染小鼠的表达和作用目的：通过检测EV71感染小鼠不同组织中P选择素糖蛋白配体-1(Mouse P-selectin glycoprotein ligand-1, mPSGL-1)的表达,探讨P选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)在EV71感染中的作用。方法：1日龄ICR小鼠11窝(66-110只)随机分为2组,实验组8窝(48-80只)每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107-5)的DMEM培养基0.1ml,另3窝(18-30只)为对照组,每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状,并分别于0d(接种病毒前)、病毒接种后、4d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠与6只对照组小鼠,取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量；应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏mPSGL-1的表达；应用免疫组织化学法检测CD4+、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞的表达；应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子：肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis fector-alfa, TNF-a)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-lbeta, IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同组织的mPSGL-1的相对表达量对CD4+、CD8+、巨噬细胞表达的影响,以及与促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β产生水平的关系。结果：EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多；mPSGL-1在EV71感染小鼠的组织中表达增加,在感染后一定时间内,mPSGL-1在中枢神经系统的相对表达量比在心脏或/和肺脏的相对表达量明显增多,尤其在脑干和大脑增多更为明显。在所被测组织中的CD4+、CD8+、巨噬细胞免疫反应染色显示也增多；另外,在EV71感染小鼠所被测组织中的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量有相关性：在感染后的4天,大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量成负相关；在感染后8天,除了心脏和肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-a产生量未有相关性外,大脑、小脑、脑干、脊髓mPSGL-1的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量仍成负相关；在感染后12天在所有被测组织未再有相关性。结论：在EV71感染时,局部组织的mPSGL-1表达增加,可能在白细胞募集与宿主的先天性固有免疫反应中起着重要作用。第三部分SCARB2在肠道病毒71型感染小鼠的表达与促炎细胞因子的关系目的：在感染性疾病时,清道夫受体(Scavenger receptor class B, member2, SCARB2)参与早期的先天性固有免疫反应；因此,本研究探讨肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染小鼠时,小鼠清道夫受体(mouse SCARB2, mSCARB2)在不同组织的表达和作用。方法：1日龄ICR小鼠13窝(78-130只)随机分为2组,感染组10窝(60-100只)每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基0.1ml,另3窝(18-30)只为对照组,每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状,并分别于病毒接种后2d、4d、6d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组与对照组小鼠,取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量；应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的表达；应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子：肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis fector-alfa, TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β (Interleukin-lbeta, IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同组织的SCARB2相对表达量与细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的关系。结果：在EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多。在感染后一定时间段内,SCARB2在中枢神经系统的相对表达量较心脏或/和肺脏的相对表达量明显升高,尤其在脑干和大脑。另外,在EV71感染小鼠的不同组织的TNF-α、IL-6和IL-1p产生量与SCARB2相对表达量有相关性：在感染后4天、8天,大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1p含量成正相关,感染后12天未再有相关性。结论：在EV71感染时,小鼠局部组织的SCARB2表达增加,可能在调节促炎细胞因子的产生中起着重要作用,尤其在中枢神经系统。
【图文】：

接种感染,ICR小鼠,临床表现

Figure 1图1. 一日龄ICR小鼠经腹腔接种感染EV71的临床表现。感染EV71小鼠的临床表现被观察到感染15天，存活率（A)，临床疾病得分（B)。结果是三次独立的实验结果。2. BrCr株EV71在感染小鼠大脑和脑干的病毒载量20

病毒载量,接种感染,ICR小鼠,线粒体

图2.经腹腔接种感染EV71的ICR小鼠不同组织的病毒载量。一日龄ICR小鼠在0天（EV71感染前）和小鼠经腹腔接种EV71在感染后5、10、15天使用乙醚吸入法麻醉小鼠，安乐处死（每个时间点处死6只），用突光定量RT-PCR检测肺脏（A)、心脏（B)、脊髓（C)、小脑（D)、大脑（E)、脑干（F)组织的病毒载量。每个标本的病毒载量重复三次，表示为（means±SEM)。3.线粒体电子显微镜小鼠感染EV71后，电子显微镜显示，在感染后5天，大脑、脑干的线粒体明显肿胀，部分线粒体外膜受损，线粒体基质清淡，线粒体嵴变短或消失（图3A，E)。在感染后10天，线粒体肿胀减轻，受损的线粒体膜和线粒体嵴部分恢复（图3B，F),在感染后的15天，，线粒体无肿胀，受损的线粒体膜和线粒体嵴完全恢复，与对照组相比无明显差别（图3C,D,G,H)。这些结果提示小鼠感染EV71后，急性期线粒体受损，随着感染时间的延长，线粒体受损渐恢复。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.2

【共引文献】