【摘要】：目的:通过实验研究明确夹脊电针对脊髓损伤大鼠NLRP3炎症小体活化及运动功能的影响,阐明夹脊电针通过调控P2X7R抑制NLRP3炎症小体活化,降低脊髓损伤后炎症反应的作用机制,为夹脊电针临床应用提供实验依据。方法:实验研究分为四部分。实验一:观察夹脊电针对SCI大鼠运动功能及脊髓组织病理形态学的影响。采用随机数字表法将36只雌性SD大鼠分成假手术组(Sham)、模型组(Model)和夹脊电针组(EA)3组,每组根据术后3d、7d时间点分为2个亚组,每个亚组6只大鼠,分别给予相应的处置或治疗。运用BBB:评分法观察各组大鼠运动功能;HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态学变化。明确夹脊电针对SCI大鼠行为学和形态学的影响。实验二:观察夹脊电针对SCI大鼠脊髓组织促炎性因子IL-18和IL-lβ表达的影响。采用随机数字表法将36只雌性SD大鼠分成假手术组(Sham)、模型组(Model)和夹脊电针组(EA)3组,每组根据术后3d、7d时间点分为2个亚组,每个亚组6只大鼠,分别给予相应的处置或治疗。ELISA法检测大鼠脊髓组织IL-18和IL-1β表达。明确夹脊电针对SCI大鼠脊髓组织促炎性因子表达的影响。实验三:观察夹脊电针对SCI大鼠脊髓组织NLRP3炎症小体活化的影响。采用随机数字表法将36只雌性SD大鼠分成假手术组(Sham)、模型组(Model)和夹脊电针组(EA)3组,每组根据术后3d、7d时间点分为2个亚组,每个亚组6只大鼠,分别给予相应的处置或治疗。IHC法检测大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1表达。明确夹脊电针抑制SCI大鼠脊髓组织NLRP3炎症小体活化的作用。实验四:观察夹脊电针对SCI大鼠脊髓组织P2X7受体表达及NLRP3炎症小体活化的影响。采用随机数字表法将48只大鼠分成假手术组(Sham)、模型组(Model)、夹脊电针组(EA)和BBG注射组(BBG)共4组,每组根据术后3d、7d时间点分为2个亚组,每个亚组6只大鼠,分别给予相应的处置或治疗。IHC法检测大鼠脊髓组织P2X7R表达;Western blot 法检测大鼠脊髓组织 P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1蛋白表达。从P2X7受体介导NLRP3炎症小体活化角度揭示夹脊电针改善SCI大鼠炎症反应的作用机制。结果:实验一:(1)BBB评分法观察各组大鼠运动功能:Sham组大鼠术后未见明显运动功能障碍,术后3d、7dBBB评分均为21分。Model组大鼠术后出现严重的后肢运动功能障碍,术后3d、7dBBB评分均明显降低,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。EA组大鼠术后3d、7dBBB评分有所升高,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态学变化:Sham组大鼠脊髓组织结构完整,灰质和白质界限清晰,细胞核形态正常,核仁大而清晰,未见炎性细胞浸润、出血坏死、组织水肿等。Model组3d时大鼠脊髓组织可见明显斑片状出血,组织疏松,有空泡形成,仅见残存的神经细胞,细胞形态改变明显,胞体变小,胞核固缩,可见大量炎性细胞浸润,可见部分浆细胞呈核固缩、核染色加深,偏于细胞一侧,胶质细胞增多。EA组3d时大鼠脊髓组织病理改变与Model组类似,可见点片状小出血灶,组织疏松,神经细胞数量较Model组增多,炎性细胞浸润及胶质细胞增多情况较Model组减轻。Model组7d时脊髓组织疏松严重,大量空泡形成,白质呈空泡退变样变化,残存神经细胞进一步减少,大量炎性细胞浸润及胶质细胞增生。EA组7d时可见组织结构趋于完整,灰质和白质界限隐约可见,组织空泡少见,炎性细胞及胶质细胞减少,取而代之以大量形状不规则的神经细胞,胞体及胞核正常。实验二:ELISA法检测各组大鼠脊髓组织IL-1 8和IL-1β表达情况:Sham组大鼠脊髓组织可见少量IL-18和IL-lβ表达,且术后3d、7d维持在稳定水平。术后3d、7d时间点,模型组大鼠脊髓组织IL-18和IL-1β表达升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。给予夹脊电针治疗后,EA组大鼠脊髓组织IL-18和IL-lβ表达下降,术后7d时间点,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。实验三:IHC检测各组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1表达情况:Sham组大鼠脊髓组织可见少量NLRP3、ASC、cleaved caspase-1在胞浆中呈棕黄色阳性表达,且术后3d、7d维持在稳定水平。术后3d、7d时间点,模型组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1阳性细胞平均光密度值升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。给予夹脊电针治疗后,EA组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1阳性细胞平均光密度值下降,术后3d、7d时间点,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。实验四:(1)IHC检测各组大鼠脊髓组织P2X7R表达情况:Sham组大鼠脊髓组织可见少量P2X7R在胞浆中呈棕黄色阳性表达,且术后3d、7d维持在稳定水平。术后3d、7d时间点,Model组大鼠脊髓组织P2X7R阳性细胞平均光密度值升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。术后7d时间点,EA组大鼠脊髓组织P2X7R阳性细胞平均光密度值降低,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。术后3d、7d时间点,BBG组大鼠脊髓组织P2X7R阳性细胞平均光密度值降低,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)Western blot检测各组大鼠脊髓组织P2X7R、NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表达情况Western blot检测各组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达情况:Sham组大鼠脊髓组织可见少量P2X7R蛋白表达,且术后3d、7d维持在稳定水平。术后3d、7d时间点,Model组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。术后7d时间点,EA组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达降低,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。术后3d、7d时间点,BBG组大鼠脊髓组织P2X7R蛋白表达降低,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot 检测各组大鼠脊髓组织 NLRP3、ASC、cleaved caspase-1蛋白表达情况:Sham组大鼠脊髓组织可见少量NLRP3、ASC、cleaved caspase-1蛋白表达,且术后3d、7d维持在稳定水平。术后3d、7d时间点,Model组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1蛋白表达升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。术后3d、7d时间点,EA组、BBG组大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、cleaved caspase-1蛋白表达降低,与Model组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:(1)夹脊电针能够改善SCI大鼠脊髓组织炎性损伤,促进运动功能恢复;(2)夹脊电针能够下调SCI大鼠脊髓组织IL-18和IL-1β表达,抑制微环境炎症反应;(3)夹脊电针能够抑制SCI大鼠脊髓组织NLRP3炎症小体过度活化,下调促炎性因子的表达;(4)夹脊电针可能通过调控SCI大鼠脊髓组织P2X7R表达,抑制NLRP3炎症小体过度活化,改善SCI大鼠炎性损伤。
【图文】：
组７ｄ时可见组织结构趋于完整，灰质和白质界限隐约可见，组织空泡少见，逡逑炎性细胞及胶质细胞减少，取而代之以大量形状不规则的神经细胞，胞体逡逑及胞核正常。见图２。逡逑Ｓｈａｍ逦Ｍｏｄｅｌ逦ＥＡ逡逑ｍｍｍ逡逑■ａｍ逡逑图２各组大鼠脊髓组织ＨＥ染色检测结果（２０0ｘ）逡逑注：黑色箭头所示为神经细胞；白色箭头所示为炎性细胞；红色箭头所示为组织空逡逑泡。逡逑３９逡逑
差异具有统计学意义（／＞＜0．０５）。以上结果表明，脊髓损伤后大鼠脊髓组逡逑织促炎细胞因子ＩＬ－１８表达升高，可能参与了脊髓损伤后炎症反应，，给予逡逑夹脊电针治疗能够下调ＩＬ－１８表达，改善炎症损伤。见表２、图３。逡逑表２各组大鼠脊髓组织丨Ｌ－１８表达（ｐｇ／ｍｇ邋）逡逑组别逦ｎ逦３ｄ逦Ｔｄ逦逡逑Ｓｈａｍ邋组逦６逦６８．３５±１７．４０逦６９．０８±１８．２０逡逑Ｍｏｄｅｌ邋组逦６逦２６３．９７±３６＿６５＃逦２９７．５３土３１．３５＃逡逑ＥＡ邋组逦６逦２１９．０７±１３．２５＃逦１６５．０４±邋１９．６３＃＊逡逑Ｆ逦９０．４３８逦１３９．３７５逡逑逦Ｐ逦＜０．００１逦＜０．００１逦逡逑注：＂ＰＣＯ．Ｏ〗，与Ｓｈａｎｉ组比较；？ＰＣＯ．ＯＳ，与Ｍｏｄｅｌ组比较。逡逑４００１逡逑■■Ｓｈａｍ逡逑＃逦ｆ逦ｆｌｉ邋Ｍｏｄｅｌ逡逑３００－逦ｔ逦丨逦「ａ逡逑ｇ逦Ｔ逦＿逦＊邋ＥＡ逡逑Ｉ＂０＇逦＂邋Ｉ邋基逡逑Ｈｉ邋＿逡逑３ｄ逦７ｄ逡逑图３各组大鼠脊毮组织丨Ｌ－】８表达（ｎ＝６）逡逑注：０．０５，与Ｓｈａｍ组比较；＊尸＜０．０５，与Ｍｏｄｅ丨组比较。逡逑４３逡逑
【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245;R-332
【参考文献】
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本文编号：
2631027
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