白藜芦醇联合hADSCs抗衰老作用及相关MET机理研究
发布时间：2020-04-18 10:53
【摘要】：目的:白藜芦醇、脂肪间充质干细胞均有抗衰老作用,本文旨在将二者联合运用与单独作用的抗衰老效果作比较并探究其中机理。方法:采用酶消化-组织块培养法中分离培养人眼睑皮下脂肪间充质干细胞(Human dipose mesenchymal stem cells,hADSCs)和人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs),流式细胞术鉴定hADSCs干细胞表型并行成脂诱导,免疫组化鉴定HDFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原;建立HDFs自然衰老细胞模型,采用transwell共培养小室将白藜芦醇(RSV)、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)和自然衰老人真皮成纤维细胞(HDFs)分组共培养,分为四个组:(1)hADSCs单独作用于衰老人真皮成纤维细胞组;(2)RSV单独作用于衰老人真皮成纤维细胞组;(3)hADSCs+RSV协同作用组;(4)对照组。采用蛋白印记的方法检测共培养后各组细胞的SIRT1和β-catenin蛋白表达情况。qRT-PCR法检测各组成纤维细胞的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-1、β-半乳糖苷酶的表达。结果:从人眼睑皮下脂肪处提取得来的细胞,培养后流式细胞术鉴定hADSCs干细胞表型:表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45,检测结果符合间充质干细胞的特异性表达。该细胞再加入成脂诱导液培养两周后可见成串脂滴形成。从眼睑真皮提取来的细胞培养后免疫组化染色表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原,鉴定结果符合成纤维细胞。在transwell小室环境下共培养后,蛋白印记的方法检测共培养后各组细胞的SIRT1和β-catenin蛋白表达情况为hADSCs+RSV协同作用组高于二者单独作用组,QRT-PCR法检测共培养后各组成纤维细胞的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达趋势为hADSCs+RSV协同作用组高于二者单独作用组。MMP-1、β-半乳糖苷酶的表达趋势为hADSCs+RSV协同作用组低于二者单独作用组。结论:原代培养源于真皮成纤维细胞在自然衰老后,白藜芦醇与脂肪间充质干细胞联合运用的抗衰老效果优于单独运用,且与间充质-上皮转化(MET)相关。
【图文】：
2ml 浓度为 25μmol/ml 的含白藜芦醇的 10%FBS 的低糖每孔置入上层提篮，但上层提篮不接种细胞，仅每篮加芦醇的 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基。③hADSCs+RSV 组：取 6 个铺有脂肪间充质干细胞新加入 1ml 含 25μmol/ml 白藜芦醇的 10%FBS 的低糖 衰老成纤维细胞的 6 孔板，吸弃原培养液，重新加入含0%FBS 的低糖 DMEM 培养基，然后小心用镊子将 6 个提好标记，随后放入 37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。④对照组：取一块铺有衰老成纤维细胞的 6 孔板，吸 2ml 含 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基，，上层提篮不接 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基。分组共培养(共培养模式图见图 1)三天后，在倒置显微学变化并拍照记录。
图 2 人脂肪间充质干细胞的培养(×100)Figure 2 culture of human adipose mesenchymal stem cells (×100)从人眼睑取得的皮下脂肪组织，用酶消化-组织块培养法得到的细胞进行原代培养，经过，将第 3 代细胞置于倒置显微镜下观察，可见沉淀组织边缘有大量贴壁生长的的细胞，状排列，x100。图 A 的细胞在高倍镜下观察细胞呈长梭形，x100。 A The subcutaneous adipose tissue obtained from human eyelid was primarily cultured bye digestion and tissue mass culture. After passage, the third passage cells were observed undered microscope. It can be seen that there are a large number of adherent cells on the edge of theitated tissue, arranged in a whirlpool shape, x100. B Fig.A cells are long fusiform under high power microscope, x100.所培养得到的第 3 代人脂肪间充质干细胞作鉴定 CD34、CD45、CD90、CD105 的流式检测尽管 MSC 暂无特异性标志物，但是根据其特异性表达 SH2、SH3、和 SH4 以
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R339.38
本文编号：2632022
【图文】：
2ml 浓度为 25μmol/ml 的含白藜芦醇的 10%FBS 的低糖每孔置入上层提篮，但上层提篮不接种细胞，仅每篮加芦醇的 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基。③hADSCs+RSV 组：取 6 个铺有脂肪间充质干细胞新加入 1ml 含 25μmol/ml 白藜芦醇的 10%FBS 的低糖 衰老成纤维细胞的 6 孔板，吸弃原培养液，重新加入含0%FBS 的低糖 DMEM 培养基，然后小心用镊子将 6 个提好标记，随后放入 37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。④对照组：取一块铺有衰老成纤维细胞的 6 孔板，吸 2ml 含 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基，，上层提篮不接 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基。分组共培养(共培养模式图见图 1)三天后，在倒置显微学变化并拍照记录。
图 2 人脂肪间充质干细胞的培养(×100)Figure 2 culture of human adipose mesenchymal stem cells (×100)从人眼睑取得的皮下脂肪组织，用酶消化-组织块培养法得到的细胞进行原代培养，经过，将第 3 代细胞置于倒置显微镜下观察，可见沉淀组织边缘有大量贴壁生长的的细胞，状排列，x100。图 A 的细胞在高倍镜下观察细胞呈长梭形，x100。 A The subcutaneous adipose tissue obtained from human eyelid was primarily cultured bye digestion and tissue mass culture. After passage, the third passage cells were observed undered microscope. It can be seen that there are a large number of adherent cells on the edge of theitated tissue, arranged in a whirlpool shape, x100. B Fig.A cells are long fusiform under high power microscope, x100.所培养得到的第 3 代人脂肪间充质干细胞作鉴定 CD34、CD45、CD90、CD105 的流式检测尽管 MSC 暂无特异性标志物，但是根据其特异性表达 SH2、SH3、和 SH4 以
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R339.38
【参考文献】
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本文编号：2632022
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