东北林区牛及人血液病毒组解析及未知新型病毒遗传特征研究

发布时间：2020-04-19 00:31

【摘要】：众所周知,病毒是一种可以在人其它生物体间传播并感染生物体的微小病原体。近些年来,再发和新发由病毒导致的流行性疾病时常发生,严重威胁人类的身体健康和生命财产安全。牛与人类的生产和生活关系尤为紧密,尤其在畜牧业发达的东北林业地区。牛在饲养过程中易受到携带致病病毒的蚊虫叮咬,以及摄入被相关致病病毒污染的水源和饲料。若感染牛的致病病毒对牛甚至是人的健康具有威胁,则牛便会成为污染源。因此,熟悉和探明东北林区牛以及其密切接触的人的血中现已掌握或尚未查明的病毒具有至关重要的意义!传统的病毒检测方法在面对未知病毒和新发病毒检测方面具有较大的局限性。基于二代测序技术的病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)的出现很好的解决了这一问题。此研究方法直接以样本中所存在的所有病毒核酸序列为研究对象,对样本中已知和未知的病毒具有较好的检出性。该技术出现和兴起为挖掘和检测新型病毒序列及对新发病毒性传染病的流行预警提供了强有力的技术支持。为了探究和掌控东北林区牛及其密切接触的人的血液中病毒群落的组成情况,以及挖掘新型的潜在致病性病毒,本研究运用了病毒宏基因组学的方法对东北林区养殖的牛及其密切接触的人的血液样品进行了研究。本研究的主要内容如下:(一)牛血液病毒组分析东北林区牛血液中的病毒群落的组成包括:未分类病毒科(None)、藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)12.64%、Mimiviridae病毒科4.44%、细小病毒科(Parvoviridae)3.22%、圆环病毒科(Circoviridae)2.22%、痘病毒科(Poxviridae)1.88%、疱疹病毒科(Herpesviridae)1.11%、虹彩病毒科(Iridoviridae)1.01%、Marseilleviridae病毒科0.86%、杆状病毒科(Baculoviridae)0.55%、联体病毒科(Geminiviridae)0.29%、Alloherpesviridae病毒科0.23%、Bicaudaviridae病毒科0.22%、逆转录病毒科(Retroviridae)0.18%、Sphaerolipoviridae病毒科0.13%、腺病毒科(Adenoviridae)0.13%、其他病毒科(Others)1.25%。牛血液病毒群落的分析显示:(1)东北林区牛血液中病毒群落的组成呈现出病毒种类的多样性。(2)在所有病毒中,未分类病毒所占比重最大,达到了69.65%,构成了东北林区牛血液病毒群落的主体。其次是藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)12.64%、Mimiviridae病毒科4.44%、细小病毒科(Parvoviridae)3.22%以及圆环病毒科(Circoviridae)2.22%。(3)这5个病毒文库中,含有多种属于如小RNA病毒科(Picornaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)等具有感染哺乳动物能力的病毒。(二)人血液病毒组分析结果显示:在东北林区与牛密切接触的人的血液中的病毒群落的组成包括:指环病毒科(Anelloviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、人类内源性逆转录病毒(HERV)。人血病毒群落分析提示:(1)人血液中病毒群落的组成种类相对较少(2)病毒DNA文库Forest05发现了三个不同种属的人类内源性逆转录病毒(HERV)核酸序列(3)病毒DNA文库Forest06发现一完整乙肝病毒核酸全基因组(三)东北林区牛及其密切接触的人的血液病毒群落的比较东北林区牛及其密切接触的人的血液病毒群落之间的组成差异较大,二者病毒群落见并无相关性,在牛血液病毒群落中存在的病毒几乎不存在于人的血液中。(四)未知新型病毒的鉴定及遗传特征分析(1)新型Circovirus在东北林区牛的血液中,发现了三个新型的完整Circovirus病毒基因组。分别命名为Bvch001、Bvch002、Bvch005。此类病毒是目前仅能够感染鸟类和猪的环形单链DNA病毒,是否具有感染牛和在牛的体内进行复制的能力尚无明确报道。本研究通过反向PCR的方法,从文库5和文库4分别得到了Bvch001和Bvch002这两个病毒全基因组核酸序列,基因全长分别为1881nt和2926nt;Bvch003在文库中已有其完整基因组。对这三个病毒全基因组进行分析发现,Bvch002包含复制蛋白基因(Rep)和衣壳蛋白基因(Cap)并且方向相同;Bvch002和Bvch005的两个复制蛋白基因(Rep)和衣壳蛋白基因(Cap)则方向相反。利用病毒的保守复制蛋白(Rep)与Gen Bank基因数据库进行BLASTp蛋白比对分析后发现,Bvch001和两支来自大猩猩的小环形病毒(KP233191 and KP233192)具有55%的相似度;Bvch002和来自蜻蜓(KM598397)的环状样病毒(circovirus-like virus)具有最高的相似度,达到38%;Bvch005和来自牛的粪便相关的环状病毒(Circovurs)具有高达38%的相似度。为了进一步验证这两株Circovirus病毒在东北林区牛的血液中的确存在,本研究基于在牛的血液中发现的这三株Circovirus病毒的核酸序列分别设计了针对这三支病毒的保守复制蛋白(Rep)基因PCR引物,对80份东北林区牛血液样本进行了检测,结果显示:在三个样本检测出Bvch001病毒核酸序列并测序比对后发现,这3个测序结果相似度大于99.3%;Bvch002和Bvch005分别都在1份样本中被检测出相应的核酸序列,随后对检测出的核酸序列进行测序并与原始病毒文库中的病毒核酸进行比对,测序比对结果显示和两个原始circovirus REP基因核酸序列完全吻合。随后利用这3支毒株的保守的复制蛋白(Rep)氨基酸序列进行系统进化分析结果显示,它们都类聚到环状病毒Circovirus。以上结果显示这两支病毒属于新型的环状病毒Circovirus。(2)新型Gemycircularviruses该病毒是新发的能够在人以及其他动物,甚至是环境样本中存在的单链环形DNA病毒。在牛的血液中,发现了两株新型的gemycircularvirus,分别命名为“BGmv001”和“BGmv002”,基因组全长分别为2192nt和2926nt。基因序列分析显示这两个病毒的基因组包含两个方向相反的基因,分别编码复制蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)这两种蛋白,而且都不含有内含子(intron)区域。根据病毒相对保守的的复制蛋白(Rep)进行BLASTp蛋白序列比对分析之后发现,这两个病毒毒株分别和来自蜻蜓的gemycircularvirus以及来自鸟类粪便的gemycircularvirus具有56%和36%的相似度。本研究根据牛血液样本发现的两个gemycircularvirus REP基因的核酸序列分别设计引物,对80份牛的血液进行检测。检测结果显示BGmv001和BGmv002都在两份样本中发现了其基因序列,对发现的BGmv001和BGmv002的两条核酸序列进行测序。BGmv001两条290bp长的核酸序列测序结果相似度为99%;基于BGmv002的两条280bp长的核酸序列测序结果相似度为98%。利用这两支病毒的保守蛋白复制蛋白(Rep)氨基酸序列进行系统进化分析,它们都和gemycircularvirus家族类聚,以上结果显示这两个病毒属于新的gemycircularvirus。(4)新型Bovine parvovirus牛细小病毒bovine pavovirus是一类小型的线性DNA病毒,可导致乳牛腹泻和成年牛呼吸道和生殖系统疾病。本研究在牛的血液中,发现了两个分别为Bovine parvovirus 2和Bovine parvovirus 3的两种新型牛细小病毒,分别命名为BPV2和BPV3。牛细小病毒包含两段排列方向相同的基因,分别编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP1)。对BPV2和BPV3的非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP1)分别进行BLASTp蛋白氨基酸序列比对和系统进化分析后发现,BPV2的NS蛋白的氨基酸序列和Gen Bank database基因数据库中的3个BPV2的NS蛋白氨基酸序列具有高达96%-98%的相似度,但是VP1蛋白的氨基酸序列却只有84%-86%的相似度。BPV3的NS蛋白氨基酸序列、VP1蛋白氨基酸序列与Gen Bank database基因数据库中唯一一个BPV3的NS、VP1有着分别高达96%和97%的序列相似度。根据以上结果本研究认为BPV2是新型的牛细小病毒bovine parvovirus。结论:(1)利用病毒宏基因组学方法掌握了牛血液及其相关人的血液病毒群落的组成;(2)牛血液病毒群落的组成呈现多样性;人血液病毒群落较为单一(3)从牛的血液中发现了2支新型的gemycircularvirus、3支新型的circovirus、一支新型的parvovirus。
【图文】：

示意图,示意图,文库,病毒

15图2.1 index primer 示意图Fig.2.1 index primer Schematic diagram（3）反应完毕后用1%浓度的琼脂糖凝胶对其进行电泳检情况。2.1.10 文库的纯化本步骤的目的是去除文库中扩增产生的引物二聚体，使样毒核酸，在操作前按照病毒文库纯化前电泳图按比例吸取各45μl 体积的病毒 DNA 文库混合物，，严格按照如下步骤执行（1）吸取 45μl PCR 文库产物混合物到新的 1.5ml 的纯净

分布情况,文库,人血,牛血

图 2.3 牛血及人血的病毒 DNA 文库质量检测Fig.2.3 The quality detection of viral DNA library from Blood of Cattle and human.2.2.1.2 病毒文库的 Bioanalyzer 检测经过电泳检测后符合要求的文库，运用 Agilent bioanalyzer 检测器 DNA 长度的范围分布情况以及 DNA 的浓度。检测结果如下图 2.4 所示，结果说明文库内的 DNA 长度的分布及 DNA 的浓度均已达到 Miseq 的测序要求，并且可以上机测序。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373;S852.65

【参考文献】