牛蒡苷单克隆抗体的制备及其ELISA免疫分析方法的建立

发布时间：2020-04-19 13:50

【摘要】：研究目的:(1)合成中药小分子牛蒡苷(ARC)的人工抗原。(2)筛选能够特异性分泌抗牛蒡苷抗体的单克隆细胞株,并制备抗牛蒡苷单克隆抗体。(3)基于获得的单克隆抗体建立酶联免疫分析方法(ELISA),并对其进行方法学考察。研究方法:采用依照本实验需求改进的高碘酸钠氧化法,制备牛蒡苷的人工抗原(免疫原和包被原)。用薄层色谱法(TLC)以及飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法对以上的合成产物进行鉴定,以确定其偶联结果。而后用合成的人工免疫原免疫小鼠,与等体积弗氏佐剂乳化均匀后背部皮下多点注射,每隔两周加强免疫一次,以充分诱导小鼠的免疫应答。四次免疫后尾尖取血,ELISA法检测抗血清的效价,评价免疫效果;间接竞争检测抗血清的特异性。取免疫后小鼠的脾脏制备脾单细胞悬液,采用PEG法将脾细胞与SP2/0杂交瘤细胞融合,筛选可分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。有限稀释法进行单克隆化以获得单克隆细胞株,采用体内腹水诱导法完成抗体的扩大生产。基于生产的牛蒡苷单克隆抗体建立间接竞争ELISA检测方法,考察该方法的特异性、灵敏度、交叉反应率、回收率等相关指标。研究结果:(1)薄层色谱鉴定和飞行时间质谱的结果说明,合成的产物ARC-BSA和ARC-OVA偶联成功;飞行时间质谱检测结果显示,人工抗原合成成功,偶联比为6:1。(2)小鼠抗血清效价在1:16000以上,标准竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与ARC产生特异性结合。取免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,筛选出了能特异性分泌抗ARC抗体的单克隆细胞株。腹水诱导法制备了大量ARC单克隆抗体(3)基于制备的ARC单克隆抗体,建立相应的ELISA分析法。包被原ARC-OVA以1:8000的浓度稀释,腹水以1:40000的浓度稀释,得到ARC单克隆抗体的抑制率与线性关系曲线,回归方程为:y =-0.2031n(x)+ 2.1102,R2=0.9969。线性范围为125~3981 ng/mL,半数抑制率IC50为1466.0ng/mL。方法学考察结果显示,加样回收率在97.5~107.4%之间(均值为102.2%),板内差异4.62%,板间差异8.67%。通过ELISA法测试ARC单抗与它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示ARC单抗与其他成分的交叉反应率均小于0.10%。说明制备的ARC单克隆抗体有良好的特异性。研究结论及意义:本实验首次成功合成了 ARC的人工抗原,为ARC单克隆抗体的筛选和制备以及相关免疫方法的建立奠定基础;首次筛选出ARC的单克隆细胞株;首次制备出了 ARC的单克隆抗体;首次利用生产出的ARC单克隆抗体建立ELISA酶联免疫吸附分析方法。本研究为牛蒡苷的检测提供了一种全新的技术手段,同时为中药牛蒡子以及含有牛蒡子的中药复方的质量控制、物质基础、体内代谢与分布、药理药效等多方面的研究奠定了基础。
【图文】：

逑３．４抗血清中ＡＲＣ抗体灵敏度测定逡逑表２－４为ＡＲＣ－ＢＳＡ免疫小鼠血清中抗体的间接竞争ＥＬＩＳＡ试验结果。图２－１为其逡逑竞争抑制曲线。从结果可以看出，４只小鼠的抗血清均具有竞争性，都可以特异性识别逡逑牛蒡苷小分子，因此四只老鼠均免疫成功成功。而这其中，２、３号小鼠灵敏度较高，且逡逑线性较好。逡逑表２－４邋ＡＲＣ－ＢＳＡ四只免疫小鼠抗血清的间接竞争试验结果逡逑Ｔａｂ．２－４邋Ｉｎｄｉｒｅｃｔ邋ｃｏｍｐｅｔｉｖｅ邋ＥＬＩＳＡ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＡＲＣ－ＢＳＡ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ｍｉｃｅ邋ｓｅｒｕｍ．逡逑￣线性方程逡逑￣Ｉ逦Ｙ＝邋－０．０９２１ｎ（ｘ）＋邋１．７００８逦０．９５３８逡逑２逦Ｙ＝－０．０８１１ｎ（ｘ）＋邋１．１７５５逦０．９８２４逡逑３逦Ｙ＝－０．０９８１ｎ（ｘ）＋邋１．１６４３逦０．９６９４逡逑４逦Ｙ＝邋－０．０６６１ｎ（ｘ）邋＋邋１．０４３６逦０．９７６４逡逑１．４邋ｒ逡逑ＡＲＣ＿１邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑Ｔ逦＃邋ＡＲＣ－２邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑１．２邋ｆ＂＂１逦逦逦邋—？—ＡＲＣ－３邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑■■■Ａ—ＡＲＣ－４邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑。６：邋＼＼逡逑０．４逦１逡逑０．２邋！逦丨逦：逦＇逦１逦逦？逦！逡逑１邋１０邋１００邋１０００邋１００００邋１０００００邋１００００００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋

３．７阳性杂交瘤细胞的筛选结果逡逑细胞融合１４天左右显微镜下观察融合效果，４块细胞培养板共３５２孔中有杂交瘤克逡逑隆细胞生长的孔为２９２个，融合率达到８２．９％邋；邋ＥＬＩＳＡ法筛初筛阳性孔，图２－２为其中逡逑一块细胞培养板的阳性筛选结果，，蓝色指示为阳性孔。继而采用间接竞争ＥＬＩＳＡ法考逡逑察阳性孔上清液的竞争性，排除假阳性孔，进一步确定阳性孔。测得阳性突出且有竞争逡逑的孔有邋１Ｇ１、１Ｈ５、１Ｂ７、２Ｃ６、２Ｅ１０、２Ａ８、３Ｂ５、３Ｅ８、４Ｆ７、４Ｄ３邋等邋１０邋个。阳性率为逡逑３．４２％。通常情况下阳性率在３％－７％的范围内属于正常，因此本次融合正常。逡逑＿＿＿－＿＿｜￣￣－￣￣｜￣＾￣４｜＂＂＂＂＂５￣６￣￣￣７￣８＾＂＂＂＂＂＂９￣１０￣￣￣￣Ｕ￣逡逑Ａ邋｜邋２．６４７逦ｉ逦２．６９３逦ｊ逦２，６４２邋ｊ邋０．１９３逦：２．７０９邋［邋０．１８７逦０．１５２逦６．１８１逦０．１７６逦０．１７４逦０．１７８逡逑Ｂ邋Ｉ邋２．５９逦０．１６３逦０．１４５逦０．１５８逦０．１５？逦［邋２．６５７邋ｊ邋0＿１４逦０．１４５逦０１４１逦０．１５逡逑Ｃ邋
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2633366