埃及伊蚊Serpin23基因克隆表达及酶活性初探

发布时间：2020-04-19 15:43

【摘要】：目的:克隆并表达埃及伊蚊(Aedes aegypti)(广东电白株)Serpin23蛋白,并对其进行酶活性检测,以探讨其可能具有的生物学功能。方法:设计基因特异性引物,采用PCR技术扩增埃及伊蚊广东电白株serpin23基因成熟肽序列,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1和麦胚无细胞表达(Wheat Germ Cell-free)载体pEU-E01-His-TEU-MCS-N2。将测序正确的原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Serpin23(rSerpin23)转入表达菌BL-21(DE3)中后经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;重组质粒pEU-Serpin23(rpEU-Serpin23)按照麦胚无细胞表达试剂盒说明书进行表达;构建pcDNA3.1-Serpin23重组质粒,将其转染到293T细胞,在DMEM培养基培养48h后收集细胞及上清。表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹(western blotting)进行鉴定。鉴定后的蛋白经GSTrap~(TM)FF和Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。采用手工法检测rSerpin23对人全血部分凝血酶原时间(prothrombin time,PT),凝血酶时间(thrombin time,TT)及凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的影响。最后采用发色底物法检测rSerpin23、rpEU-Serpin23和pcDNA3.1-Serpin23蛋白对胰蛋白酶的抑制作用。结果:Serpin23序列全长为1254 bp,具有信号肽序列,生物信息学分析显示其具有Serpin结构域。PCR扩增获得其成熟肽序列,将其克隆入pGEX-4T-1和pEU-E01-His-TEU-MCS-N2载体,经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明rSerpin23重组质粒构建成功。重组质粒测序结果显示,Serpin23成熟肽序列长1197 bp,编码399个氨基酸。与网上序列(登录号:DQ439995)进行比对,在第904位置的T碱基突变成C碱基,为同义突变。将构建好的重组质粒rSerpin23转入大肠杆菌BL-21(DE3)中经IPTG诱导后获得可溶性rSerpin23蛋白;重组质粒pEU-Serpin23在麦胚无细胞表达系统中成功的表达出了rpEU-Serpin23重组蛋白;重组质粒pcDNA3.1-Serpin23转染入293T细胞后在细胞中检测到重组蛋白表达。经Western blotting证实获取的重组蛋白rSerpin23、rpEU-Serpin23和pcDNA3.1-Serpin23是目的蛋白。在1.0μM rSerpin23作用下,PT、TT和APTT分别为13.29 S、15.34 S和36.72 S,均无延时效应。此外,酶标仪动态检测产物吸光度值发现,rSerpin23、rpEU-Serpin2和pcDNA3.1-Serpin23重组蛋白均不能够抑制胰蛋白酶活性。结论:三种方法均成功获得埃及伊蚊(广东电白株)Serpin23重组蛋白,未检测到其具有抑制胰蛋白酶的活性。
【图文】：

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图 1 Serpin23 蛋白的信号肽分析Fig. 1 The signal petide analysis of Serpin23 protein性分析性对蛋白质结构的折叠起着重要作用，通过 ExPASy 的 Proin23 蛋白的疏水性。结果显示，Serpin23 蛋白的亲水性)值为-0.330，说明该蛋白是个亲水性蛋白（如图 2）。

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图 1 Serpin23 蛋白的信号肽分析Fig. 1 The signal petide analysis of Serpin23 protein2 疏水性分析疏水性对蛋白质结构的折叠起着重要作用，，通过 ExPASy 的 Protscale Serpin23 蛋白的疏水性。结果显示，Serpin23 蛋白的亲水性平均AVY)值为-0.330，说明该蛋白是个亲水性蛋白（如图 2）。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R384.1

【参考文献】