铜绿假单胞菌cntRLMN操纵子的功能研究

发布时间：2020-04-20 05:12

【摘要】：金属元素是生物的正常生存所必需的。在金属缺乏的环境中,细菌普遍采取的应对策略是首先在细胞内合成金属载体,并将金属载体分泌到胞外以螯合胞外游离金属离子,再进一步通过外膜受体转运至胞内实现在金属匮乏的环境中对金属离子的摄取。锌(Zn)对于所有的生物都是非常重要的微量元素,锌在细菌中可以与蛋白质结合帮助蛋白形成必要的结构以完成其相应的功能,锌还可以在金属酶中作为辅助因子,参与金属酶的催化作用。在细菌的致病性方面,维持细菌体内锌离子的稳态对于细菌在宿主体内的成功定植、繁殖非常重要。细菌可以通过锌离子转运系统维持细胞在各种环境中锌离子的平衡。本研究以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为研究对象,铜绿假单胞菌是一种条件致病菌,是医院内最常见的感染菌种之一。铜绿假单胞菌主要会引起烧伤病人的感染、插入导尿管或外科手术病人的感染,囊性纤维化症(CF)病人肺部感染的主要菌群也为铜绿假单胞菌,同时,铜绿假单胞菌也容易引起呼吸道、泌尿系统的感染和引起菌血症病。由于铜绿假单胞菌具有广泛的抗生素耐药性,因此对于治愈由铜绿假单胞菌引起的疾病非常困难。本研究围绕着铜绿假单胞菌PAO1中锌离子转运相关的操纵子cntRLMN和调控蛋白Zur展开研究。首先利用相关文献分析,发现了铜绿假单胞菌操纵子cntRLMN与负责合成多功能金属载体staphylopine的金黄色葡萄球菌操纵子SacntKLM同源,为了验证基于此的推测,在已经敲除锌离子转运系统ZnuBC的突变株基础上通过同源重组的方法获得了Δzur、BCR(ΔznuBCΔcntR)、BCL(ΔznuBCΔcntL)、BCN(ΔznuBCΔcntN)等突变株,并利用pME6032质粒构建了这些突变株的遗传互补菌株,利用pMini-CTX∷lacZ获得了启动子的转录融合报告菌株,使用pET28a构建了蛋白表达纯化的载体和菌株。先前的文献已经表明cnt操纵子的启动子上存在Zur调控蛋白的假定结合位点,因此通过β-半乳糖苷酶活性的测定,本研究得出cnt操纵子受到Zur蛋白的负调控。通过凝胶迁移阻滞实验(EMSA),本研究得出了Zur能够直接结合PcntR'启动子。通过对不同锌离子浓度下的生长曲线分析表明,ZnuBC和CntL、CntR、CntN均参与铜绿假单胞菌锌离子的摄取,它们的功能存在互补性,由于ZnuBC是已知的锌离子摄取系统,因此CntRLMN是另一种独立的锌离子摄取系统。通过对外源添加细胞提取物的生长曲线分析和结合文献报道,本研究得知CntL可能通过控制合成锌载体参与锌离子的摄取;CntR是外膜受体,将外界的锌载体转运至周质空间;CntN是一个内膜转运蛋白,通过将胞内的锌载体转运至周质空间来参与铜绿假单胞菌的锌离子的摄取。通过互补cntR、cntL、cntN和zur基因恢复了cnt操纵子锌离子的摄取功能及Zur蛋白的调控功能,再次证明了cnt操纵子参与铜绿假单胞菌中锌离子的摄取和Zur蛋白对cnt操纵子的调节控制。其次,通过β-半乳糖苷酶活性的检测得出了自身基因的突变不会影响cnt操纵子的表达,并且通过重金属离子的毒性筛查实验表明cnt操纵子不影响铜绿假单胞菌对重金属的耐受力。最后本研究通过大蜡螟幼虫侵染实验表明铜绿假单胞菌的cnt操纵子突变菌株对大蜡螟幼虫的毒性显著降低。最终,本研究提出了cnt介导锌离子转运的假定分子模型,简述为铜绿假单胞菌的CntL在细胞质中合成的zincophore通过CntN转运到周质空间,再通过一未知的外膜通道蛋白分泌到胞外,进而螯合胞外的锌离子形成zincophore-Zn~(2+)复合物,该复合物进一步通过外膜受体CntR和一未知的内膜转运蛋白转运回细胞质,锌离子则在胞内积累并与调控蛋白Zur结合而抑制cntRLMN操纵子的表达。通过本实验,我们不仅解决了铜绿假单胞菌中锌离子摄取中的一些问题,而且还为铜绿假单胞菌中锌离子摄取系统的研究带来了新的进展,为靶向锌离子摄取系统的新型抗菌药物的开发提供了新的靶点。
【图文】：

图 1-1 不同细菌 staphylopine 生物合成基因簇的比较Figure 1-1 Comparison of staphylopine biosynthetic gene clusters of different bacteria1.3 本研究的内容和意义本研究是以模式病原细菌铜绿假单胞菌为研究材料，，以铜绿假单胞菌中锌离子摄取的途径为研究对象，以ΔznuBC 为出发菌株，通过目的基因突变株、遗传互补菌株、lacZ 染色体转录融合报告菌株的构建，EMSA，β-半乳糖苷酶的测定，生长曲线分析等手段研究了 Zur 蛋白对 cnt 操纵子的转录调控，Zur 蛋白与 cnt 启动子的体外直接结合，及对 cnt 操纵子上 cntR、cntL、cntN 等基因的锌离子摄取功能进行了分析和鉴定，同时也研究了自身基因的突变是否影响 cnt 操纵子的表达和 cnt 操纵子是否参与铜绿假单胞菌中其它重金属离子的摄取。最终，通过构建大蜡螟幼虫的侵染模型来研究 cnt 操纵子对铜绿假单胞菌毒力发挥的影响。通过本项研究，我们不仅将回答当前铜绿假单胞菌中锌离子摄取研究领域所存

本研究的主要技术路线图
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 沈健;冯晨;林允照;郑文华;顾华;蒋锦琴;冯磊;;铜绿假单胞菌生物膜形成机制及耐药相关性[J];浙江预防医学;2015年01期

2 Kosorok M.R. ,Farrell P.M. ,姜志茹;黏液型铜绿假单胞菌感染的纵向发展与囊性纤维化患儿肺疾病进展[J];世界核心医学期刊文摘(胃肠病学分册);2005年06期

本文编号：2634194