空肠弯曲菌ermB基因携带菌株与对照菌株的组学比较研究

发布时间：2020-04-22 04:59

【摘要】：作为重要的食源性病原菌之一,空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)主要引起人的胃肠炎,甚至引发神经性疾病如格林巴利综合症等。大环内酯类药物如红霉素是治疗空肠弯曲菌感染的首选药物,但由于长期不适当使用,空肠弯曲菌对该类药物产生了耐药性,使抗生素治疗效率下降,严重威胁人类临床医疗健康。造成空肠弯曲菌对大环内酯类耐药的主要原因有碱基替换、核糖体蛋白突变和外排泵作用,此外,erm基因编码的甲基化酶也是造成大环内酯类耐药的主要原因之一。本研究分别采用转录组学、蛋白组学和代谢组学技术探索空肠弯曲菌ermB基因携带菌株和对照菌株的差异谱及相应的生物学功能,从RNA水平、蛋白水平和代谢物水平研究空肠弯曲菌中ermB基因表达的适应性代偿分子调控机制。转录组学分析,通过提取空肠弯曲菌ermB基因携带菌株和对照菌株的全菌RNA,构建cDNA文库,RNA-Seq高通量测序技术对文库进行测序,参考C.jejuni NCTC 11168标准菌株基因组,经数据预处理过滤掉不合格的读取,基因表达量FPKM标准化后进行转录本相对定量,共筛选到58个差异转录本,其中1个发生上调,上调倍数为5.52倍;57个发生下调,下调倍数为3.33-426.95倍。对这些差异转录本进行生物功能分析发现上调基因cj1477c参与乙醛酸盐和二元羧酸盐代谢;下调基因flgE、flgK、flaA、flaB、fliD、flgS、flgD、flg1、flgE2、flgH、cj0887c、flgB、flgG、flgG2、fliS、flgC参与细菌鞭毛的组装,hisH、hisF参与组氨酸代谢,cj0489参与乙醛酸盐和二元羧酸盐代谢,pseB、pseC、ptmB参与氨基糖和核苷糖代谢。qRT-PCR对部分差异转录本进行表达量验证,结果与测序数据计算的变化倍数一致,表明了测序的准确性和可靠性。蛋白组学分析,采用超声破碎法提取空肠弯曲菌ermB基因携带菌株和对照菌株的全菌蛋白质,FASP法酶解蛋白为肽段,采用MRM-MS技术对差异转录本对应的产物蛋白进行相对定量。共筛选到20个差异蛋白质,其中4个发生上调,上调倍数为1.52-4.71倍;16个发生下调,下调倍数为1.66-79.64倍。对这些差异蛋白质进行GO注释和KEGG分析,发现上调蛋白Cj1450参与ATP/GTP绑定过程,FlgG2参与鞭毛基体杆组装及依赖于鞭毛的细胞运动,Cj0850c参与转运过程,Cj1422c参与糖转移过程;下调蛋白FlgD、FlgE2、FlgI、FlaB、FlaA、FlgG参与细菌结构分子活动,FlgE2、FlaB、FlaA、FlgD参与依赖于鞭毛的细胞运动,FlgE2、FlaB、FlaA、FlgD、FlgI、FlgG、PtmA 参与鞭毛组装,Cj1477c、Cj1476c、HisF、PtmA、HisH 参与代谢通路,Cj1477c、HisF2、HisH1参与生物二级代谢物合成,PseB、PseC参与氨基糖和核苷糖代谢,HisF2、HisH1参与组氨酸代谢和氨基酸的生物合成,FlaB、FlaA、FlgS为双组分系统相关蛋白。通过负染及电镜观察细菌鞭毛表明ermB基因携带菌株鞭毛丝缺失,而敏感株鞭毛完整。运动性、自身凝集性及细胞实验结果显示ermB基因携带菌株运动性减弱,自身凝集性降低,对HEp-2、VERO和IEC-6细胞粘附力和侵袭力均减弱。ELISA检测结果表明ermB基因的表达使空肠弯曲菌的葡萄糖和ATP含量上调,次黄嘌呤含量下调。代谢组学分析,采用液氮淬灭细菌代谢,冷甲醇冻融循环提取全菌代谢物,C18柱和HILIC柱分离代谢物,QTOF-MS检测特征离子,MarkerLynx软件多元统计分析数据,共筛选鉴定到36个差异代谢物,其中14个发生上调,上调倍数为1.50-10.65倍;22个发生下调,下调倍数为1.51-12.70倍。对这些差异代谢物进行HMDB和KEGG分析,其主要参与细菌细胞信号功能(3个上调,5个下调),膜的完整性和稳定性(3个上调,5个下调),能量的来源和储存(3个上调,5个下调)及营养(4个上调,3个下调)等生物功能。根据差异代谢谱生物功能和细胞定位的结果,检测细菌生物膜形成能力,结果表明ermB耐药菌的生物膜形成能力减弱。综上所述,ermB基因在空肠弯曲菌中表达产生耐药表型后,导致空肠弯曲菌鞭毛丝缺失,运动能力减弱,自身凝集性降低,粘附力和侵袭力降低,葡萄糖和ATP含量上升。同时,次黄嘌呤含量显著下调。上述研究结果进一步阐明了空肠弯曲菌中ermB基因耐药调控的分子机制,为空肠弯曲菌耐药性的防控提供了科学依据。
【图文】：

技术原理,概况,技术,转录本

逦１邋１邋ｉＭ逡逑Ｇｅｎｅ邋１２邋３邋４逡逑图１－１邋ＤＮＡ微阵列技术原理图（引自Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ逡逑ＲＮＡ－Ｓｅｑ技术Ｍ将高通域测序方法与计算方法结合起来，以捕获和Ｍ化ＲＮＡ提取物中的转逡逑录本｜１Ｗ１。生成的核苷酸序列的长度一般在ｌＯＯｂｐ左右，但根据使用的测序方法，可以从３０个ｂｐ逡逑到１０，０００个ｂｐ不等。与ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ相比，ＲＮＡ－Ｓｅｑ中５个数保级的动态范围是一人优势。此外，逡逑需要的进样量也较少，ＲＮＡ－Ｓｅｑ为纳克级，ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ为微克级。理论上，ＲＮＡ－Ｓｅｑ技术没有逡逑定量上限，在测量非重复区域ｌＯＯｂｐ片段时背景值很低。可以通过富集０标ＲＮＡ或删除己知丰逡逑度的ＲＮＡ来提高ＲＮＡ－Ｓｅｑ的灵敏度。ｍＲＮＡ分子可以用绑定到ｐｏｌｙ－Ａ尾的霖核ｔ）：酸探针分开。逡逑转录分子被制备好后，可进行单向或双向测序，特定ｓｔｒａｎｄ的ＲＮＡ－Ｓｅｑ方法可保留测序转录本逡逑的ｓｔｒａｎｄ的信息［ｍ］。ＲＮＡ－Ｓｅｑ原理见图卜２。在生物体中，，基闪被转录并拼接（在寅．核生物中）以逡逑产生成熟的信使ＲＮＡ转录本（图中红色标记）。ｍＲＮＡ从生物体中提取

阳性对照,红霉素,测序,克林霉素

图２－２邋２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４及２０７５位测序图谱逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ｏｆ邋ｐｏｉｎｔ邋２０７４邋ａｎｄ邋２０７５邋ｏｆ邋２３Ｓ邋ｒＲＮＡ逡逑注：ａ为ＣＴ－１１１６８的２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４和２０７５位测序图谱，ｂ为ＣＪ－ｅｒｍＢ的２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４和．２０７５位测序围谱逡逑２．３．２邋ＭＩＣ邋测定逡逑对ＣＪ－１１１６８及ＣＪ－ｅｒｍＢ的ＭＩＣ测定结果表明ＣＪ－１丨１６８对红霉素及克林霉袭均敏感，ＣＪ－ｅｒ对红霉素及克林霉素耐药，且ＭＩＣ分别提高了邋１２８倍及１０２４倍（表２－４）。且２＿３．１结果己
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378

【参考文献】