基于化学探针与斑马鱼模型的中药活性成分筛选方法研究

发布时间：2020-04-22 02:54

【摘要】：中药药效物质研究是中药现代化进程重要内容。由于中药成分复杂,从中药混合物中筛选发现药效物质具有一定难度。本文建立了分子水平筛选与活体筛选相结合的中药活性成分筛选方法,着重研究了基于小分子化学探针和斑马鱼模型的3种中药活性物质筛选方法。本论文研究内容主要包括:1.建立了一种基于聚集诱导发光(AIE)效应探针的SIRT3调节剂筛选方法。设计了基于AIE效应的小分子探针,由一个作为荧光发色基团的四苯基乙烯(TPE),与SIRT3酶能够识别的底物多肽Gln-Lys(Ac)-Arg-Phe-Asn通过固相合成得到。通过对体外反应体系的pH、缓冲盐浓度、探针浓度等因素的优化,该探针能够在体外特异性检测SIRT3活性,并具有较低的检测限。有望用于中药中SIRT3调节剂筛选。2.建立了一种基于花生四烯酸诱导斑马鱼血栓模型的中药活性物质筛选方法,并用于丹红注射液活性成分筛选与质量评价。采用邻联茴香胺对斑马鱼心脏与尾部红细胞染色并获取血栓的显微图像,以心脏红细胞强度为指标评价血栓形成情况。结果表明,该模型能够较准确地评价阳性药阿司匹林的抗血栓活性。运用该方法评价了丹红注射液的抗血栓活性,发现丹红注射液能剂量依赖性地减轻花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓,丹参与红花提取物也有较好抗血栓活性。筛选出丹红注射液中迷迭香酸、对香豆酸等抗血栓活性成分,进一步结合对丹红注射液中化合物含量分析,发现迷迭香酸和对香豆酸可作为丹红注射液抗血栓活性相关质量标志物。并且该方法有望用于批次一致性评价。3.建立了一种基于化学探针与斑马鱼血瘀血虚模型相结合的中药活性多重评价方法。对绿色荧光蛋白(GFP)标记血红蛋白的转基因斑马鱼用苯肼损伤,通过荧光成像获取血液流动情况来定性表征血瘀血虚证型。采用小分子探针NP3特异性地原位检测斑马鱼体内过氧化亚硝酸盐ONOO-,以探针荧光强度来描述斑马鱼氧化应激损伤和炎症程度,通过流式细胞术检测GFP标记的红细胞强度并以此为指标来评价血瘀血虚情况,实现了双重活性指标检测。运用该方法评价了丹红注射液及丹参、红花提取物的活性,表明丹红注射液能显著抗红细胞损伤和氧化损伤。该方法有望用于双重指标的中药活性成分筛选。
【图文】：

去乙酰化,探针

２．４．３．１基于质谱的反应特异性验证逡逑按２．３．３．１方法反应并采用质谱检测，发现该探针能够被ＳＩＲＴ３识别并生成去逡逑乙酰化产物。从图２．３质谱上看出去乙酰化后生产的产物峰比原来前移，说明其去逡逑乙酰化后溶解度提高。逡逑１００－．逡逑Ａ邋二邋（、？（、逦？0－，逦，＿逡逑—逦ＴＰＥ－ＱＫ（Ａｃ）ＲＦＤ逡逑８０－逦ｓｏ：逡逑Ｐ邋：逦＾邋Ｍ逦ｌ邋－逡逑１邋６0－逦＾邋ｔ邋ｉ邋Ｔ邋３８９７邋卜逡逑Ｑ）逦＿逦ｐ邋Ｎ丨Ｈ邋’：－？逦２０逡逑｜逦４0－逦＂Ｙ邋＊Ｔ逦？：咖逦９yU咖逡逑冬逦＿逦５００逦？０0逡逑Ｕ－逦＿逦ｍ邋？逡逑0邋－邋ｒｌｌＩ邋）逦２３．７３＿２６邋５０逦３邋８／ｇ＿｜邋３９，＾８邋４４．０９邋４９．８２逦６４邋００逡逑Ｂ邋１００１邋—逦Ｌ—Ｊ＾逦＾￣’逡逑８０二逦ＴＰＥ－ＱＫＲＦＤ逦＾逡逑＿逦３逦0逦ｇ逦0逦ｐ逦－逡逑－－邋■邋？邋－邋，邋－邋ｌ邋－ｓ－邋■邋－邋ｉ．邋￣逦■＇逡逑６０邋二逦ｉ邋＃邋Ｓ邋ｔ。逦｜＊°：逡逑—逦ｉ－ｏ邋６ｈ．邋ｃｍ．．逦｜邋０？■逡逑＿逦心邋—邋Ｈ－逦｜邋４０逡逑＿逦ＣＪ逡逑４０－逦…逦３５．０５逦２０：逡逑—逦－２＾９0８逦Ｋ？ｔ？ｉ逡逑—逦ｃｏｏ逦？００逡逑２０—邋＊＂■＇＊逡逑二逦v|６逦３0９逡逑ｒｉ二」“■邋—Ｌ－８９逦２０．１０邋２３．３８＿２７

正交实验,探针,探针反应,体系研究

逦１５０逡逑时间（ｍｉｎ）逡逑图２．４探针与ＳＩＲＴ３反应前后荧光随时间变化逡逑２．４．４邋ＳＩＲＴ３与探针反应的最佳体系研究逡逑采用ＳＰＳＳ对数据进行统计分析得到如图２．５的结果。表明反应效率相对最高逡逑时所采用的条件为Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ浓度为５０ｍＭ，邋ｐＨ＝８，邋ＮＡＤ＋浓度为３ｍＭ。在该条件逡逑下，由图２．６的总离子流图可看出：该条件下加入ＳＩＲＴ３反应２ｈ后，探针的峰几逡逑乎完全消失，说明探针几乎被反应完全。逡逑ｔｔ＊的ｔｔＷ边zL均怕逦ｔｔ＊的ｔｔ算边私均值逡逑逦——ｉ邋，彳逦……邋－ｒ邋一邋一逦／逡逑＾逦＼逦Ｉ逦／逡逑ｔｆ，，逦ｌ逦＼＿＾逦ｚ逡逑？？逡逑１逦Ｓ逦Ｍ逦—８逦￥４逦ＢＳ￣逦０１逦１逦３逡逑Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ？Ｃ；ｆｔ逦ｐＨ逦ＮＡＤ？浓甩逡逑图２．５正交实验结果直观图逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332

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