硫氧还蛋白互作蛋白参与HCV诱导细胞自噬以及逃避宿主固有免疫

发布时间：2020-04-24 01:15

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒,是引起人类急、慢性肝炎的重要病原体。HCV感染极易慢性化,其慢性率高达80%。HCV慢性感染是肝硬化、肝癌等严重终末期肝病的重要原因。长效干扰素联合利巴韦林曾经是治疗HCV感染的标准方案,其疗效受基因型的影响,且总体不甚理想。近年来上市的新一代直接抗病毒药物(direct antiviral agents,DAAs)(如Ledipasvir和Sofosbuvir)使丙肝治疗现状发生重大改变,但这些药物费用昂贵,无法在短期内普及使用,副作用以及耐药突变等也有待更长时间的观察。HCV基因组高度变异,这是HCV逃避宿主适应性免疫而高发慢性感染的重要原因。除了变异以外,HCV还进化有其他复杂的免疫逃避机制,尤其是逃避固有免疫应答的机制,促使HCV慢性感染的发生。HCV分子克隆以后的近三十年,丙肝疫苗研究一直受到发达国家的重视,有多种类型的疫苗进入或已经完成了Ⅰ、Ⅱ期临床期试验,但目前没有一种进入Ⅲ期临床试验阶段。HCV的高变异使得疫苗研制举步维艰,另一方面,HCV感染是否足以诱导保护水平的免疫应答也存在争议。HCV感染的药物治疗虽然取得了巨大进展,但对于HCV慢性感染和免疫逃避机制的认识还有很多未知,有待进一步深入发掘,阐明这些错综复杂的问题,不仅能为人类控制HCV感染,也能为人类认识其他病毒持续感染的机制提供重要线索。事实上,HCV目前已经被作为研究病毒慢性感染机制的重要模型,在抗HCV药物研发取得巨大进展以后,HCV感染与致病机制依然受到学者的广泛关注,研究热度依然不减。我们之前的研究发现HCV感染显著上调Huh7细胞中硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达,且HCV感染高度依赖于TXNIP的表达。本论文在此基础上,对HCV感染诱导TXNIP表达以及TXNIP促进HCV感染的机制进行了探索。本研究中,我们开展了以下实验、获得了如下结果:1)进一步观察和证实了HCV感染上调Huh7细胞中TXNIP的表达以及TXNIP分子对HCV感染的重要作用;2)通过RNA干扰技术确认抑制细胞自噬导致Huh7细胞中HCV感染的下调,以及抑制TXNIP的表达明显降低无血清饥饿对细胞自噬的诱导;3)对HCV感染的Huh7细胞进行内质网应激相关标志分子的检测,未观察到HCV感染对内质网应激的诱导;4)HCV感染Huh7细胞能低水平激活IFN-β的转录,外源性IFN-β能剂量依赖性上调Huh7细胞中TXNIP的表达;5)HCV全长RNA和HCV 3’-UTR转染Huh7细胞能诱导IFN-β的产生和上调TXNIP的表达;6)Huh7.5.1细胞转染RIG-I表达质粒以后,细胞内TXNIP的表达水平升高,且HCV感染能进一步上调TXNIP的表达,而HCV感染对naive Huh7.5.1内的TXNIP表达无上调作用;7)Redd1分子可能与TXNIP协同参与对HCV感染的调控;8)钙离子拮抗剂维拉帕米能通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染。本论文通过上述研究建立了一种HCV慢性感染新机制的作用模型:HCV感染刺激宿主产生低水平干扰素(无论细胞模型中这种作用的高低程度如何,人类和黑猩猩感染HCV在肝组织内普遍检测到干扰素表达的明显上调),干扰素上调TXNIP的表达,TXNIP则通过促发细胞自噬增强HCV的复制。干扰素刺激表达的TXNIP不同于其他干扰素刺激基因表达产物,其作用不是抑制病毒感染,而是相反。基于这一发现,我们证明了一种临床用于治疗高血压的廉价药物维拉帕米通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染,其用于临床治疗丙型肝炎的前景值得进一步探讨。
【图文】：

自噬,HCV感染,诱导细胞,转录组

硕士学位论文及自噬标志分子 LC3-Ⅱ蛋白表达水平，qRT-PCR 检测 HCV 感水平。结果显示，相较于未感染组，HCV 感染 48 h 和 72 h和 mRNA 表达水平均显著上调（图 1A、图 1B），表明 HC表达，与我们前期基因芯片分析以及转录组深度测序结果一8 h 和 72 h 时细胞中 LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高，，且 72 组（图 1A），表明 HCV 感染诱导细胞自噬发生。

HCV感染,自噬,数显,蛋白

硫氧还蛋白互作蛋白参与 HCV 诱导细胞自噬以及逃避宿主固有免疫抑制 TXNIP 表达后 HCV 感染的阳性细胞数显著减少（图 2A）。Western blot 结果显示抑制 TXNIP 表达后 HCV core 蛋白以及自噬标志蛋白 LC3-Ⅱ的表达较对照均明显降低（图 2B）。用 TXNIP 慢病毒感染 Huh7 细胞，随后用 HCVcc 感染，免疫荧光结果显示过表达TXNIP 的Huh7细胞被HCVcc感染以后，HCV阳性细胞数显著增加（图2C），Western blot 结果显示 HCV core 蛋白和 LC3 蛋白表达水平上调（图 2D）。结果表明 TXNIP 的表达对于 HCV 感染至关重要。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】