细胞色素P450氧化还原酶（CPR）及其它氧化还原酶对造血干细胞功能调控的研究

发布时间：2020-04-24 09:41

【摘要】：背景：造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)具有自我更新,增殖以及多向分化的能力,但是调节HSC功能的机制有待进一步研究。HSC微环境对HSC正常功能的发挥具有重要调节作用。细胞内外的氧化还原代谢是HSC微环境至关重要的一方面,因而对HSC的功能发挥一定调控作用。CPR (cytochrome P450reductase)是所有已知的CYPs (cytochrome P450s)的电子供体,其可能通过内源性和外源性机制调节HSC正常功能的维持。目的：本研究利用全身低表达CPR的RCL (reverse CPR low)转基因小鼠模型,研究CPR/CYPs对造血的影响。方法：通过流式分析检测WT和RCL小鼠的LT-HSC、ST-HSC、MPP、CMP、MEP、 GMP、CLP、T、B、M和G细胞比例。全骨髓细胞竞争移植实验、富集LKS+移植实验检测RCL来源的HSC增殖重建以及分化能力的变化。将WT全骨髓细胞移植入RCL小鼠受体实验检测RCL微环境对造血的影响。分别通过DCF-DA、细胞周期、凋亡检测RCL小鼠造血干祖细胞中ROS、周期和凋亡的变化。结果：流式分析结果显示,与WT相比,RCL小鼠中LT-HSC、ST-HSC减少,CMP、 GMP和MEP增多,成熟细胞数量没有明显变化。竞争移植实验结果显示来源于RCL小鼠的HSC重建能力增强,同时其分化能力不受影响。RCL小鼠的全骨髓细胞、HSC和造血祖细胞(HPC)中ROS水平没有明显改变。此外,WT全骨髓细胞移植入RCL小鼠受体微环境中其增殖重建能力不变,但淋系细胞分化比例减少,髓系细胞分化比例增多。结论：CPR低表达能增强HSCs重建效率,同时CPR低表达微环境能诱导淋系细胞分化比例减少,髓系细胞分化比例增多。背景：所有造血细胞均来源于造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC),HSC分化呈明显等级关系。细胞中ROS (reactive oxygen species)对造血干细胞维持发挥重要的调控作用,然而过多的ROS会促使造血干细胞衰老。细胞主要通过氧化还原酶以及抗氧化物清除胞内ROS达到ROS稳态,从而避免过多的ROS对细胞的损伤。细胞内的氧化还原酶有多种,包括过氧化氢酶(Catalase)、锰-超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GPX1)、NQO1[NAD(P)H dehydrogenenase quinone1]、血红素加氧酶1(heme oxygenase1, Hmox1)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase1,Txnrdl)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GSR)。Nrf2/Keap1/Cul3复合物参与调控以上氧化还原酶。以上氧化还原酶及其上游的Nrf2等调控基因在呈等级分化的各类血细胞中的表达以及Nrf2对HSC中氧化还原酶的调控还不清楚。目的：检测造血各系细胞中氧化还原酶的表达,包括LT-HSC、ST-HSC、MPP、CMP、 MEP、GMP、CLP、T、B、M以及探究Nrf2对HSC中氧化还原酶调控作用。方法：本研究应用流式细胞分选技术,分选出小鼠造血各系细胞(LT-HSC、ST-HSC、 MPP、CMP、MEP、GMP、CLP、T、B、M),半定量实时PCR (semi-quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测氧化还原酶(Catalase、MnSOD、GPX1、Nqo1、Txrndl、Hmox1和GSR)及调控基因(Nrf2、Keap1和Cul3)在造血各系细胞中的表达。体外不同剂量Nrf2小分子激活剂(Sulforaphane)分别处理c-Kit和LKS+(Lin-c-Kit+Sca-1+)细胞不同时间后,qRT-PCR检测Nrf2及其相关调节基因表达。结果：Catalase、MnSOD、GPX1、Nrf2、Keap1、Cul3在造血各系细胞中表达相对细胞特异的,其表达水平与细胞分化程度没有明显相关性。Nqo1在LT-HSC的表达明显高于其他各系细胞。Txrndl仅在ST-HSC、MPP、CMP、GMP和髓系细胞表达较高,在T淋巴细胞和B淋巴细胞中表达降低。Hmox1在CLP和髓系成熟细胞中表达升高,在ST-HSC、MPP、CMP、GMP、MEP、T淋巴细胞和B淋巴细胞中表达降低。GSR在ST-HSC、MPP、GMP和髓系成熟细胞中表达增高,在MEP和淋系细胞中表达降低。Sulforaphane体外作用c-Kit-细胞和LKS+细胞都能诱导Nrf2下游调控基因表达,主要包括Nqol、Hmoxl、Txrndl。值得注意的是,相较于c-Kit-细胞组,LKS+细胞的所有处理组Keap1表达均升高,包括对照组。结论：氧化还原酶在造血各系细胞的表达呈现较大差异,提示在不同细胞中发挥主要作用的氧化还原酶种类不同。更为重要的是,Nqo1在LT-HSC中表达明显高于其他各系,提示其在HSC中发挥重要调节作用,通过调控Nqo1的表达可能实现对HSC功能的调节。Sulforaphane体外作用c-Kit-细胞和LKS+细胞都能诱导Nrf2下游调控基因表达,主要包括Nqo1、Hmox1、Txrndl。在某些情况下如应激,我们可能通过小分子sulforaphane作用HSC,保护增强其功能。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】