慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9转染兔退变髓核细胞的体内实验研究

发布时间：2020-04-26 08:21

【摘要】：目的:构建兔椎间盘退变的动物模型,利用慢病毒(lentivirus vector,LV)介导MMP3-siRNA和Sox9双基因体内转染兔退变髓核细胞,探讨单基因及双基因联合转染兔退变髓核细胞的生物学效应。方法:1.4月龄新西兰大白兔使用针刺纤维环法构建兔椎间盘退变实验动物模型,手术后4周、8周行核磁共振检查及病理学检测,观察目的椎间盘的退变情况,及目的椎间盘造模成功情况。2.30只建模成功的新西兰大白兔随机分为6组,分别为(1)空白对照组,(2)PBS对照组,(3)空病毒组,(4)MMP3组,(5)Sox9组,(6)双基因组(MMP3-siRNA+Sox9),分别于造模的椎间盘髓核用微量注射器注入20μL:PBS磷酸盐缓冲液、r LVX-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-sh RNA-m CMVmcherry、rLVX-CMV-h Sox9-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-sh RNA-m CMVmcherry+rLVX-CMV-hSox9-m CMV-mcherry。于注射后8、12、24周行MRI检查观察椎间盘退变情况。术后24周空气栓塞法处死实验动物,取出目的椎间盘组织,行Western-Blot检查II型胶原、蛋白多糖水平的表达,行RT-PCR检查MMP3mRNA和Sox9 mRNA表达水平。结果:1.手术成功后4周、8周对实验动物行腰椎MRI检查,获得其核磁共振的T2WI像。第8周手术组椎间盘的MRI的T2WI像信号开始减弱,病理学检测结果示椎间盘呈退变改变,提示造模成功。2.将目的基因转染到实验动物体内后8、12、24周行磁共振检查:空白对照组、PBS组、空病毒组退变椎间盘MRI的T2WI像信号强度明显低于MMP3、Sox9和双基因组。空白对照组、PBS组、空病毒组两两比较MRI的T2WI像信号强度比较无统计学意义(P0.05);MMP3组、Sox9组MRI的T2WI像信号强度比较无统计学意义(P0.05);MMP3组、Sox9组与双基因组MRI的T2WI像分别比较显示具有统计学意义(P0.05)。术后第24周,Western-Blot检查各组II型胶原、蛋白多糖表达,其中MMP3组、Sox9组和双基因组的II型胶原表达量有不同程度提高,双基因组II型胶原的表达均高于其他各组(P0.05)。MMP3组和双基因组蛋白多糖的表达高于其他组(P0.05),Sox9组与PBS组、空病毒组比较,蛋白多糖表达未见明显升高(P0.05),双基因组II型胶原的表达均高于其他各组(P0.05);RT-PCR检查各组MMP3、Sox9 mRNA的表达情况,其中MMP3组、双基因组与PBS组、空病毒组、Sox9组比较MMP3mRNA表达水平明显降低(P0.05),其中双基因组MMP3 mRNA的表达水平均低于其他各组(P0.05)。Sox9组和双基因组与PBS组、空病毒组及MMP3组比较Sox9 mRNA的表达水平明显升高(P0.05),其中双基因组Sox9 m RNA的表达水平均高于其他各组(P0.05)。结论:1.针刺纤维环法构建兔退变椎间盘实验动物模型方法成功有效,术后8周实验动物椎间盘影像学及病理学检查均显示造模成功。2.慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9双基因体内转染对兔退变髓核细胞有明显的延缓椎间盘退变的作用,明显的促进了退变椎间盘细胞外基质中II型胶原,MMP3-si RNA基因的转染促进蛋白多糖的表达,Sox9基因过表达不会促进蛋白多糖的表达。
【图文】：

青岛大学硕士学位论文2． 实验方法2.1 术前准备及麻醉术前常规禁食 24 小时，实验动物经耳缘静脉使用 1.5%戊巴比妥钠 2ml/kg 进行注射麻醉。麻醉成功后动物取右侧卧位固定于兔实验台上。2.2 定位及手术手术经右侧腹膜外入路，选取兔腰背部右侧肋弓下缘至右侧髂棘处剃毛备皮，备皮分为约 18*10cm 区域。依次定位 L1-L7腰椎棘突，选取 L3-L7横突下缘作为手术切口。（图 1、2）

图 3、4 针刺椎间盘及术后切口缝合2.3 术后处理术后实验动物当天禁食，术后第一天常规进食、进水，术后 3 天每天给予青霉素 G 钠 80 万 UI 肌肉注射预防感染。3． 观察方法及指标3.1 术后实验动物一般情况术后密切观察实验动物麻醉苏醒后的活动情况、术后 3 天观察实验动物的切口是否感染、愈合及存活情况。3.2 病理学检测术后 8 周处死实验动物，观察目的椎间盘镜下 HE 染色及免疫组织化学表现。3.3 MRI 扫描检查实验动物于术后 4 周、8 周进行核磁共振检查，观察椎间盘退变情况。实验动
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5;R-332

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 张惠煊;马翰斐;陈少初;叶伟;刘尚礼;;RNA干扰对大鼠腰椎间盘细胞Fas表达及细胞凋亡的影响[J];广东医学;2013年23期

2 张闻力;李涛;龚全;石锐;赵小丹;丰干钧;王贝宇;刘熹;刘浩;;三种方法建立兔椎间盘退变模型的比较研究[J];中国修复重建外科杂志;2010年01期

3 熊蠡茗;郭兵;邵增务;杨述华;谢卯;王河忠;;腺病毒载体搭载的TIMP-3基因对兔椎间盘基质的调节作用(英文)[J];中国矫形外科杂志;2009年05期

4 唐家广;袁文;陈会生;王新伟;陈华江;;不同时间硬膜外应用吲哚美辛对大鼠机械性痛敏的影响[J];中国疼痛医学杂志;2008年02期

5 朱建福;刘国辉;;椎间盘退变基因治疗的研究进展[J];中国矫形外科杂志;2007年21期

6 ;IL-1beta sensitizes rat intervertebral disc cells to Fas ligand mediated apoptosis in vitro[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年10期

7 王元元;董万利;胡锦;;RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡[J];上海医学;2006年08期

8 李小川,李雷,王欢,崔少千,白伦浩;Fas/FasL基因在退变腰椎间盘组织中的表达及诱导凋亡作用[J];中华医学杂志;2005年24期

9 陆志东,金群华,陈志荣;大鼠非压迫性髓核突出模型的建立[J];中国矫形外科杂志;2003年Z2期

，

本文编号：2641296