细胞自噬在巨细胞病毒感染复制中的作用研究

发布时间：2020-04-26 11:19

【摘要】：研究背景巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)属β疱疹病毒亚科,其中感染人类的是人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV),在人群中普遍感染。人群感染HCMV后通常呈潜伏感染,对健康人体并没有明显短期危害,但对免疫功能低下的个体,如艾滋病患者、器官移植患者、干细胞治疗患者、肿瘤患者及使用免疫抑制剂的患者可造成致死性损伤¨。对婴幼儿而言,HCMV是最常见的先天性感染病毒,是引起人类中枢神经系统感染的主要病原之一,可导致胎儿畸形及迟发性中枢神经系统损伤等。此外HCMV长期反复激活感染也引发一些慢性疾病,如动脉粥样硬化等。现代病毒学认为程序性细胞死亡即是病毒感染导致机体损伤机制又是宿主本身一种抗病毒机制,宿主可通过程序性细胞死亡可以清除病毒感染的细胞,抑制病毒复制。很多针对病毒感染的治疗,包括化疗以及免疫治疗均通过诱导病毒感染的细胞死亡而实现。程序性细胞死亡主要分为两种,I型为细胞凋亡(apoptosis),Ⅱ型是自噬性细胞死亡(autophagy)。过去关于细胞凋亡机制和信号传递的研究帮助我们对病毒感染致病的生物学特性有了一定的了解,并且在治疗新策略方面为我们提供了一些潜在的分子靶点。相反,其它形式的程序性细胞死亡在病毒致病性中的作用却研究较少。研究目的在此项研究中,我们将着力于掌握细胞自噬及其mTOR信号通路在HCMV感染过程中的作用。本项目研究的具体目的如下： 1.掌握HCMV感染诱导宿主细胞自噬及其mTOR信号通路表达变化； 2.掌握细胞自噬及其mTOR信号通路在HCMV感染复制过程中的作用及其机制。研究方法 1.检测HCMV感染不同时期诱导宿主细胞自噬状态以及nTOR信号通路关键分子及其下游蛋白的表达水平将HCMV以MOI为1接种HELF细胞(人胚肺成纤维细胞),设立灭活病毒对照组,作用1h、2h、4h、8h、24h、2d、4d、8d后分别作如下检测： 1.1自噬通过以下方法检测：电子显微镜检测自噬性细胞死亡形态学结构、吖啶橙细胞染色荧光显微镜检测细胞自噬、流式细胞仪定量检测吖啶橙荧光颗粒阳性细胞数、构建自噬标记物pGFP-LC3转染HELF细胞,经不同组HCMV感染后激光共聚焦显微镜检测自噬激活、Western检测自噬标记物LC3表达。 1.2mTOR信号通路关键分子表达水平检测：Western Blot检测各组细胞mTOR信号通路关键分子p-p70S6K(磷酸化的p70S6K)、 P-4E-BP1(磷酸化的4E-BP1)表达水平。 2.通过对使用自噬抑制剂、促进剂作用后不同时间点的病毒感染、复制、释放动力学检测,判断宿主细胞自噬状态对病毒增殖复制过程中的影响。事先分别用自噬抑制剂3-MA及自噬诱导剂雷帕霉素用于HELF细胞,然后将HCMV以MOI为1分别接种HELF细胞(人胚肺成纤维细胞),设立灭活病毒对照组,作用12h、24h、36h、48h、60h。 2.1病毒增殖动力学检测：收集细胞培养物和上清,冻融三次后,空斑实验检测病毒滴度。 2.2病毒特异性蛋白表达检测：采用免疫印迹实验检测不同时间点病毒特异性蛋白表达变化。 2.3病毒基因拷贝数检测：荧光定量PCR检测。 3.建立巨细胞病毒感染动物模型技术,在体实验验证巨细胞病毒感染导致宿主细胞自噬状态改变。 BALB/c小鼠经腹腔接种小鼠巨细胞病毒(MCMV),建立小鼠巨细胞病毒感染小鼠模型,通过病毒分离、免疫荧光和PCR技术检测模型小鼠感染状态,通过Western Blot检测细胞自噬关篱蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表达水平和透射电镜检测检测模型小鼠肺组织细胞自噬。研究结果 1.吖啶橙染色、转染GFP-LC3荧光显微镜观察和透射电镜观察结果表明HCMV感染12h可明显促进HELF细胞自噬,HCMV感染36h后转变为抑制HELF细胞自噬。免疫印迹检测发现HCMV感染12h抑制mTOR自噬信号通路下游关键分子表达,感染36h后转变为促进mTOR信号通路下游关键分子表达。 2.自噬诱导剂雷帕霉素组HCMV AD169株病毒DNA拷贝数、HCMV pp65蛋白表达量及病毒滴度均较正常对照组高,而自噬抑制剂3-MA组HCMV AD169株病毒DNA拷贝数、HCMV pp65蛋白表达量及病毒滴度均较正常对照组低。 3.在建立MCMV急性感染小鼠肺组织模型基础上,透射电镜检测结果显示,MCMV感染组小鼠肺组织可看见明显细胞自噬改变；Western检测结果发现,与正常对照组相比,MCMV感染组LC3-Ⅱ表达上调,结果表明MCMV急性感染促进小鼠肺组织细胞自噬。结论 1.本研究发现HCMV感染早期促进宿主细胞白噬,感染晚期变为抑制宿主细胞自噬,而mTOR自噬信号通路参与其中。 2.本研究分别从分子、蛋白和细胞水平证实了促进宿主细胞自噬可从一定程度上促进HCMV增殖,抑制宿主细胞自噬可从一定程度上抑制HCMV增殖。 3. MCMV急性感染促进小鼠肺组织细胞自噬。
【图文】：

HBHH图1 >>丫咬dト旧鄄煜赴訮疟浠疉:对照细胞;B: HCMV感染HELF细胞12h结果；C; HCMV感染HELF细胞24h结果；D: HCMV感染HELF细胞36h结果；E; HCMV感染HELF细胞48h结果；F: HCMV感染HELF细胞60h结果Fig. 1 Acridine orange staining for autophagyA: control cells; B:HELF cells infected with HCMV for 12h;C:HELF cells infected with HCMV for 24h; D:HELF cells infected with HCMV for 36h;E: HELF cells infected with HCMV for 48h; F:HELF cells infected with HCMV for 60h1.2.2 n丫徒澄染色后流式细胞仪对细胞自唾泡进行定量检测取对数生长期HELF细胞制成细胞悬液移至到6孔培养板中，附壁后当细胞于6孔板生长汇合至70%?80%时，然后将HCMV以MOI为1接种HELF细胞，，分别作用12h、24h、36h、48h、60h,，收集各时间点细胞，用细胞刮刀刮下来，吹匀，形成单细胞悬液。B丫晾橙用PBS稀释为终浓度0.5ug/ml，室温下避光染色15min，离心弃染液，再用PBS洗3次

流式细胞仪检测,对照组,细胞

HBHH图1 >>丫咬dト旧鄄煜赴訮疟浠疉:对照细胞;B: HCMV感染HELF细胞12h结果；C; HCMV感染HELF细胞24h结果；D: HCMV感染HELF细胞36h结果；E; HCMV感染HELF细胞48h结果；F: HCMV感染HELF细胞60h结果Fig. 1 Acridine orange staining for autophagyA: control cells; B:HELF cells infected with HCMV for 12h;C:HELF cells infected with HCMV for 24h; D:HELF cells infected with HCMV for 36h;E: HELF cells infected with HCMV for 48h; F:HELF cells infected with HCMV for 60h1.2.2 n丫徒澄染色后流式细胞仪对细胞自唾泡进行定量检测取对数生长期HELF细胞制成细胞悬液移至到6孔培养板中，附壁后当细胞于6孔板生长汇合至70%?80%时，然后将HCMV以MOI为1接种HELF细胞，分别作用12h、24h、36h、48h、60h,，收集各时间点细胞，用细胞刮刀刮下来，吹匀，形成单细胞悬液。B丫晾橙用PBS稀释为终浓度0.5ug/ml，室温下避光染色15min，离心弃染液，再用PBS洗3次
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【参考文献】