背根神经元Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道介导细胞因子GM-CSF所致痛觉行为作用及分子机制的研究

发布时间：2020-04-26 12:06

【摘要】：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是血液系统最常见的生长因子之一,它可以促进骨髓中造血祖细胞分化成熟为中性粒细胞集落和巨噬细胞集落。目前,细胞因子GM-CSF在临床上广泛用于治疗骨髓发育不全综合征、再生障碍性贫血、肿瘤放疗和化疗引起的粒细胞减少等,其最严重的不良反应即为骨痛,发生率高达90%。有研究表明,细胞因子GM-CSF在外周神经重塑以及骨转移癌疼痛等方面发挥重要作用;GM-CSF受体抗体及GM-CSF受体敲低均可以显著缓解骨转移癌疼痛。GM-CSF受体大量表达于小鼠背根神经节,激活后主要通过三种信号途径进行信号传导,包括Jak-Stat信号通路、MEK/ERK丝裂原活化蛋白激酶信号通路和PI3K激酶信号通路,这些信号通路都直接或间接参与疼痛的调节。然而目前对于GM-CSF调节背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元离子通道功能从而介导痛觉行为,以及所涉及的细胞内信号转导通路并不清楚。DRG神经元是痛感觉传入的初级神经元,是痛感觉信号产生传导的重要部位。在疼痛信号刺激下,背根神经节上的伤害感受器能够将各种伤害性热、机械、化学信号转化成电信号传递至中枢神经系统。成年大鼠背根神经节上至少表达五种不同的电压门控性钠通道,包括对TTX敏感的Nav1.1、Nav1.6和Nav1.7钠通道,以及对TTX不敏感的Nav1.8和Nav1.9钠通道。Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9钠通道均主要分布在小直径的DRG神经元,与疼痛的发生关系最为密切。Nav1.7通道突变会导致遗传性红斑肢痛病(inherited erythromelalgia,IEM)、阵发性极度疼痛障碍(paroxysmal extremepain disorder,PEPD)、先天性痛觉缺失(congenital insensitivity topain,CIP)等疾病,Nav1.8基因的功能获得性突变可能与疼痛性周围神经病变有关,Nav1.9通道突变也会导致家族性发作型疼痛综合症。我们前期工作筛选了给予GM-CSF刺激后背根神经元中多种已报道和疼痛相关离子通道的mRNA表达水平,结果显示Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道mRNA表达水平显著增高。在此基础上,我们对GM-CSF上调Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道与痛觉的关系以及机制进行了深入研究。本论文将分为两部分:第一部分:通过DRG套管直接给药模型,探讨直接在DRG给GM-CFS上调Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道引起大鼠痛觉行为的作用;第二部分:探究GM-CSF诱导Nav1.7,Nav1.8,Nav1.9上调的机制。第一部分背跟神经节局部给予GM-CSF上调Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道并引起大鼠痛觉行为目的:探究GM-CSF靶向DRG给药后,对DRG神经元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9 mRNA表达水平及大鼠疼痛行为的影响。方法:(1)建立靶向DRG套管给药模型,将套管插入并固定在大鼠DRG(L5)位置,通过套管局部给予GM-CSF,使用von Frey纤维针测量大鼠的机械刺痛阈值,使用热辐射装置测量大鼠的热痛阈值,观察大鼠的疼痛行为;(2)体外分离培养DRG神经元,GM-CSF孵育4小时或24小时后,采用实时荧光定量PCR检测DRG神经元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道mRNA表达水平;(3)通过套管局部注射Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道的反义核苷酸敲低大鼠DRG(L5)中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9的表达水平,探究Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道在GM-CSF引起痛觉行为中的作用。结果:(1)GM-CSF通过DRG套管给药可以浓度依赖性地引起大鼠机械刺痛和辐射热痛痛阈阈值降低。通过套管给大鼠注射200 ng或20 ng GM-CSF后于第1 h、2 h、5 h、12 h、24 h分别测定大鼠的机械刺痛和辐射热痛痛阈,结果发现与生理盐水组相比大鼠的机械刺痛痛阈和辐射热痛痛阈显著降低(*P0.05),但是注射2 ng GM-CSF后对大鼠的疼痛行为没有影响。(2)用GM-CSF孵育培养DRG细胞4 h后,与control相比,Nav1.7(1.45±0.18倍,n=11,*P0.05)、Nav1.8(3.8±0.4倍,n=11,*P0.05)、Nav1.9(1.56±0.15倍,n=11,*P0.05)mRNA的表达水平显著升高;孵育24h后,Nav1.7(1.75±0.23倍,*P0.05)、Nav1.8(2.25±0.3倍,*P0.05)、Nav1.9 mRNA(1.6±0.23倍,*P0.05)的表达水平也显著升高。(3)靶向DRG注射Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9反义核苷酸,分别敲低大鼠DRG(L5)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道的表达水平后给予GM-CSF于第1 h、2 h、5 h、12 h、24 h分别测定大鼠的机械刺痛和辐射热痛痛阈,发现敲低Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道的表达水平后逆转了GM-CSF引起的疼痛行为。结论:GM-CSF可能是通过增高DRG中的Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道表达水平从而引起疼痛。第二部分GM-CSF通过Jak2-Stat3信号通路上调Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道mRNA表达水平目的:探究细胞因子GM-CSF诱导Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道mRNA表达水平上调的细胞信号传导机制。方法:(1)体外分离培养DRG神经元,孵育GM-CSF及信号通路阻断剂,实验分为四组,分别为control组,GM-CSF组,AG490+GM-CSF组(AG490为Jak2阻断剂),Stattic+GM-CSF组(Stattic为Stat3阻断剂),在加入GM-CSF之前分别将阻断剂AG490提前15 min,Stattic提前30 min加入到细胞中,采用实时荧光定量PCR检测给予Jak2和Stat3特异性抑制剂后,DRG神经元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道mRNA表达水平。(2)体外分离培养DRG神经元,孵育GM-CSF,采用免疫荧光技术检测给予Jak2特异性抑制剂前后,DRG神经元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道蛋白表达水平。(3)通过套管局部注射Jak2、Stat3和Stat5a反义核苷酸敲低大鼠DRG(L5)中Jak2、Stat3和Stat5a的表达水平,经套管再给予GM-CSF观察大鼠的疼痛行为。结果:(1)mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测结果显示,DRG神经元孵育GM-CSF后,三个Na~+通道mRNA的表达水平与对照组相比显著增加:Nav1.7(1.45±0.18倍,n=11,*P0.05)、Nav1.8(3.8±0.4倍,n=11,*P0.05)、Nav1.9(1.56±0.15倍,n=11,*P0.05);Jak2的特异性拮抗剂AG490预处理背根神经元后再加入GM-CSF刺激即AG490+GM-CSF组,结果显示三个Na~+通道mRNA的表达水平与GM-CSF组相比显著降低:Nav1.7(0.63±0.13倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.8(0.52±0.19倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.9(0.72±0.15倍,n=6,~#P0.05);Stat3的特异性拮抗剂Stattic预处理背根神经元后再加入GM-CSF刺激即Stattic+GM-CSF组,结果显示三个Na~+通道的表达水平与GM-CSF组相比显著降低:Nav1.7(0.4±0.22倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.8(0.68±0.17倍,n=10,~#P0.05)、Nav1.9(0.26±0.12倍,n=6,~#P0.05)。(2)蛋白表达水平。孵育GM-CSF后,与control组相比Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9钠通道蛋白的表达水平显著升高;Jak2的特异性拮抗剂AG490预处理背根神经元后再加入GM-CSF刺激即AG490+GM-CSF组,与GM-CSF组相比结果显示Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道蛋白的表达水平显著降低(*P0.05 GM-CSF组与control组比较;~#P0.05AG490+GM-CSF组与GM-CSF组比较)。(3)通过套管局部注射Jak2、Stat3、Stat5a反义核苷酸分别敲低大鼠DRG(L5)Jak2、Stat3、Stat5a表达水平后,给予细胞因子GM-CSF于第1 h,2 h,5 h,12 h,24 h,48 h分别测定大鼠的机械刺痛和辐射热痛痛阈,发现敲低Jak2、Stat3表达水平后逆转了GM-CSF引起的疼痛行为(~#P0.05与单独给予GM-CSF组比较),而反义核苷酸敲低Stat5a后,再给予细胞因子GM-CSF,大鼠仍然出现明显的机械疼痛和热疼痛反应。结论:Jak2-Stat3信号通路是GM-CSF上调Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道表达引起痛觉行为的关键靶信号通路。
【图文】：

流程图,套管,流程图

图 1 套管手术操作流程图Fig. 1 The DRG cannula implant(A) A set of pictures of the DRG cannula surgery. (B) Schematic of the DRcannula implant[31,32].

图 2 GM-CSF 对大鼠疼痛行为的影响Fig. 2 The effect of GM-CSF on nociceptive behavior of ratsDose-dependent effects of GM-CSF onpaw withdrawal threshold mechanical stimulus (A) or paw withdrawal latency to noxious heat (B) at 12 h, 5 h, 12 h and 24 h following focal DRG application via DRG cannuNumber of experiments is indicated as n in each panel. *P < 0.05 as comparto the vehicle saline.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R338.3

【参考文献】