细胞毒性基因—天花粉蛋白的重组腺相关病毒包装系统的构建

发布时间：2020-05-01 19:22

【摘要】：目的:基于mi RNA122对含有靶序列基因的调节功能,通过应用内源mi RNA对转基因表达的负向调控作用,减少目的基因-天花粉蛋白载体中转基因片段的异位表达,构建细胞毒性基因r AAV载体的包装系统。方法:(1)质粒构建:首先,利用分子组装技术将基因片段嵌入由鸡β-肌动蛋白启动子及巨细胞病毒增强子(CBAp)驱动的质粒中,并将插入位点定位于两个末端重复序列(ITR)之间,获得一系列用于r AAV制备的目的基因载体。(2)细胞转染:然后将目的基因构建到腺相关病毒载体,将构建好的重组质粒导入细胞中,检测目的蛋白的表达。(3)双报告基因检测:通过Gaussia Luciferase和Firefly Luciferase报告基因检测,测得报告基因的表达水平,并建立表达mi R122水平更高的细胞株,以增强对mir122T上游基因的调控能力。(4)重组腺相关病毒的包装及纯化:运用q PCR,Western Blot等技术比较原细胞株与新细胞株的一系列生物特性,以检测用于包装r AAV的可行性。结果:内源性和外源性mi R-122具有组织特异性,并可对靶序列基因的表达进行调控;分选获得过表达mi R-122和GLuc的HEK293-mir122-GLuc细胞株,mir122抑制靶序列的表达的作用同样适用于HEK293-mir122-GLuc细胞株,并且在生长速度与转染效率上都优于原有HEK293细胞;并将mir122T序列插入细胞毒性基因表达框的3’端非编码区域以降低工程细胞内毒性基因的表达水平,最终应用该病毒包装系统进行了细胞毒性基因的r AAV载体的制备及感染。结论:细胞毒性基因-天花粉蛋白的重组腺相关病毒包装系统构建成功。
【图文】：

靶序列,巨细胞病毒,分子组装技术,增强子

6图 1 所示，通过 PCR 及化学合成的方法获取目的基因片段后，利用分，将基因片段嵌入由鸡β-肌动蛋白启动子及巨细胞病毒增强子（CBA粒中，并将插入位点定位于两个末端重复序列（ITR）之间，获得一系V制备的目的基因载体。于本实验室前期研究[22]，CBAp 启动子元件可持续稳定表达外源目的基研究目的基因在稳定转录条件下，miR122 及其靶序列的相互作用对基后调控对目的基因表达的影响。据此，我们将 miR122 及 5 个与 miR1的串联靶序列单元（miR122T 5x）分别插入 GLUC 基因上游（A）及 3’端非翻译区域（B），通过建立荧光素酶报告系统，用于验证该表达否完整；并将编码天花粉蛋白（E,F）及白喉毒素（图略）的基因嵌入

序列,双荧光,荧光素酶,报告系统

图 2 各实验组中 Gaussia 及 Firefly 两种荧光素酶的表达水平注：采用双荧光素酶报告系统验证 miR122 能够抑制携有 miR122 靶位点载体目的基因的表达。2.2 内源性 miR122 具有组织特异性，并可对靶序列基因的表达进行调
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346

【参考文献】