抗流感病毒和EV71新靶标及新药物研究

发布时间：2020-05-01 12:01

【摘要】：A型流感病毒可引起人和动物急性上呼吸道感染，会导致一些免疫力较弱或者免疫失调的感染者患上严重并发症，如肺炎或心脏衰竭，导致高发病率和死亡率。A型流感病毒还能够引起全球性大流行，致上千万人死亡，造成人们心理恐慌，增加社会不稳定因素和经济负担。由于流感病毒变异性高、宿主广泛、传播途径多样，目前流感疫情防控形势严峻。 流感疫苗是一种有效防治流感病毒的措施，不过针对流行毒株的疫苗开发具有明显滞后性。抗病毒药物是阻击流感病毒的第一道防线。临床使用药物都已发现有耐药性问题，开发新型抗流感病毒药物需求与日俱增。通过基因沉默技术抑制病毒复制相关宿主靶标以达到阻断病毒复制的策略，能够实现广谱抗病毒，并且减轻病毒耐药性产生。 在前期工作中，通过蛋白组学方法证实了促凋亡蛋白PDCD5（programmedcell death protein5）参与流感病毒RNA合成，靶向PDCD5的硫代反义寡核苷酸（PS-ASODN） prop5体外具有明显抗流感病毒活性。本文旨在进一步体内验证prop5抗流感病毒活性并研究prop5抗流感病毒活性的机制。 体内抗病毒活性研究表明，在感染流感病毒前30min和24h两次滴鼻给药prop5（10和20mg/kg/d）能够显著提高感染小鼠存活率（P 0.01），延长平均存活天数（P 0.01），减轻感染小鼠体重下降。在病毒感染后第2、4和6天，prop5（10和20mg/kg/d）预处理小鼠病毒滴度与未给药小鼠相比显著下降（P 0.05和P 0.01）。prop5（20mg/kg/d）预处理小鼠在感染第6天小鼠肺指数显著下降（P 0.05）。此外，prop5能够抑制流感病毒感染小鼠肺组织内的细胞凋亡。 在确定prop5体内外具有显著抗流感病毒活性基础上，进一步研究其抗流感病毒机制。体内外实验证明prop5能够抑制其目的蛋白PDCD5表达，同时也能够抑制流感病毒感染后所诱导PDCD5的过量表达。通过TUNEL染色证明prop5能够在体内外抑制流感病毒引起的细胞凋亡。western blot分析证明prop5在感染小鼠中抑制Bax表达和促进Bcl-2的表达。并且prop5能够抑制凋亡执行蛋白caspase-3活性和标志性蛋白PARP的剪切。体外实验研究表明prop5抑制流感病毒感染细胞，通过溶血抑制试验和间接免疫荧光技术发现prop5抑制了流感病毒介导的膜融合，干扰病毒遗传物质释放到细胞内。prop5这种抑制膜融合的活性与其双亲性的特性和空间结构有关。prop5进入细胞内能够抑制流感病毒的复制，通过免疫荧光技术和western blot证实prop5阻断了病毒核糖核蛋白复合体（RNPs）从细胞核运输到细胞质的过程。 综上所述，prop5在体内外实验中表现出明显的抗流感病毒活性，为新型抗流感病毒药物提供候选核酸药物，为深入研究流感病毒-宿主相互关系提供新的研究视角。 肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是一种重要的嗜神经性肠道病毒，是引起手足口病的主要病原之一。在严重的病理条件情况下，EV71引起的相关的神经系统疾病包括脑炎、无菌性脑膜炎、运动神经元死亡和脑干脑炎。EV71感染导致的肺水肿和心肺衰竭是EV71高致死率的主要原因。 本实验中，构建了EV71BrCr株10个蛋白的诱饵载体采用酵母双杂交在成人脑cDNA文库中筛选获得35对病毒蛋白-宿主蛋白相互作用关系，捕获29个宿主蛋白。其中18个蛋白具有跨膜结构域定位在生物膜系统上，主要参与信号转导、胞内运输、凋亡调控等功能。文献查阅发现其中的14蛋白已经通过Y2H或/和免疫共沉淀等方式证实同其他病毒蛋白产生相互作用。对其中一对相互作用即ATP6V0C蛋白-病毒3A蛋白相互作用进行了验证，，采用免疫共沉淀和荧光双标技术证实它们能够相互作用并且共定位于细胞质。初步确定ATP6V0C参与病毒生活周期。总之，以上工作为研究EV71感染脑细胞机制和筛选抗EV71宿主靶标奠定基础。
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第 2 章 prop5 抗流感病毒活性及其机制研究结果p5 减少流感病毒感染小鼠死亡率和体重下降检测 prop5 抗流感病毒活性的体内活性，我们采用了小鼠适应株1/47（H1N1）病感染 BALB/c 小鼠模型。prop5 分为 3 个剂量（/kg/d），随机序列 prop5R（20 mg/kg/d）作为阴性对照，感染后结果表明，prop5（20 mg/kg/d 和 10 mg/kg/d）两组的 10 只小鼠下来，prop5（5 mg/kg/d）组有 8 只小鼠存活。相反，阴性对照kg/d）组与病毒感染对照组小鼠全部死亡。prop5 处理的小鼠比和阴性对照 prop5R 组表现出更少的感染症状（图 2-1A）。并且病毒感染小鼠平均体重下降且呈剂量依赖性（图 2-1B）。

注：与病毒感染组对照相比，** P ＜ 0.01； x ± s，n = 3图 2-2 prop5 减少感染小鼠肺部组织流感病毒 RNA 拷贝数Figure 2-2 Reduction of influenza virus RNA copies by prop5 in infected mice lung tissue1.4.3 prop5 降低感染小鼠肺组织 PDCD5 的表达通过荧光定量 RT-PCR 检测 PDCD5 mRNA 在小鼠肺组织表达水平。结果 2-3A 所示，与流感病毒感染小鼠相比，prop5（10 和 20 mg/kg/d）处理的感鼠 PDCD5 的 mRNA 的表达水平显著降低（两者 P < 0.05）。进一步检测 PDC白在 prop5 处理的 mock-感染和流感病毒感染小鼠肺组织中的表达水平情况ALB/c 小鼠在 prop5 处理后滴鼻生理盐水（mock-感染）或者感染流感病/FM/1/47（H1N1），在 1、3 和 6 d.p.i.，分别收集 mock-对照小鼠和流感病毒小鼠肺组织样品。通过蛋白质印迹分析检测 PDCD5 的表达情况，结果证op5 抑制 mock-对照小鼠肺组织 PDCD5 蛋白表达（图 2-3B 左）；同时在流感感染小鼠肺组织中，prop5 以剂量依赖性方式抑制病毒感染引起的 PDCD5 的过量表达（图 2-3B 右）。
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.13

【参考文献】

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1 Kazuyoshi Kuwano;;Epithelial Cell Apoptosis and Lung Remodeling[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年06期

本文编号：2646622