下丘脑-腺垂体-性腺轴对基因修饰鼠所致性别相关心血管表型差异的影响及其机制研究

发布时间：2020-05-02 19:06

【摘要】：研究背景及研究目的:大量临床观察和基因修饰动物模型资料显示,心血管表型具有显著的性别差异。一般认为,雌激素对心血管系统具有保护作用,而雄激素则可加重心血管系统的损伤。然而,在对妇女绝经后综合征进行大规模激素替代疗法的临床观察表明,雌激素替代疗法不仅可导致体内激素水平失衡,同时还有增加心血管疾病以及女性肿瘤的风险。目前,对这种不同性别所致的心血管表型差异的分子机制研究仅限于性激素对靶器官的作用,其分子机制还远未阐明。我们曾发现FKBP12.6基因敲除(FKBP12.6-/-)后仅雄性小鼠发生心肌肥大,CD38基因敲除(CD38~(-/-))后仅雄性小鼠心功能增强,我们还观察到CD38~(-/-)小鼠血清睾酮,雌二醇和LH水平上调。我们推测FKBP12.6和CD38基因修饰可能通过上调了中枢下丘脑-腺垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis:HPGs)而发挥作用,但具体机制还不明确。因此,我们提出假说:各种原因导致的HPGs激活是引起性别相关心血管表型差异的主要原因。本研究旨在以FKBP12.6和CD38基因敲除小鼠作为基因修饰动物模型,深入探讨下丘脑-腺垂体-性腺轴对基因修饰小鼠所致心血管表型差异的调控作用及其机制,同时,我们以新近制备的Tet-on诱导性下丘脑特异性表达Gn RH1转基因小鼠验证我们的假说。实验方法:1.为了明确FKBP12.6缺失对心脏的直接作用,我们首先检测FKBP12.6-/-小鼠心脏钙离子相关通路蛋白Ca MKⅡ和Calcineurin(Ca N)、MCIP1、MCIP1.4、雄激素受体和雌激素受体的表达变化。2.为了明确性激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中的作用,我们首先将雄性小鼠睾丸摘除观察小鼠心脏体重比变化。同时采用放免法(RIA)和ELISA法检测FKBP12.6-/-小鼠睾酮、雌二醇、LH和FSH分泌水平。3.为了明确FKBP12.6-/-对HPGs的调控部位,我们采用RT-QPCR和western blot法比较了垂体神经元细胞LβT2和下丘脑神经元细胞GT1-7中FKBP12.6的表达,观察FKBP12.6干扰后GT1-7细胞中Gn RH1的表达变化和LβT2细胞中LHβ、Nur77、SF-1的表达变化。同时采用Fluo-3钙离子探针检测LβT2细胞内钙离子浓度变化,最后western blot检测LβT2细胞胞浆胞核中Ca N/NFAT通路相关蛋白的表达变化(ERK1/2、Ca N、MCIP1.4 Nur77、NFAT3、Pin1)。4.Sirt1被证明可调控HPGs的功能,为了明确Sirt1在CD38~(-/-)小鼠下丘脑中的作用机制,我们采用RT-PCR和western blot检测GT1-7细胞中CD38干扰并加入Sirt1抑制剂EX527后,Sirt1、Ac-P53、Gn RH1及其转录因子Otx2的蛋白表达变化。5.为了验证我们的假说,即各种原因导致的HPGs激活是引起性别相关的心血管表型差异的主要原因,我们制备了Tet-on诱导性下丘脑特异性Gn RH1转基因小鼠。当小鼠成年后给予DOX可诱导小鼠下丘脑特异性Gn RH1过表达;免疫荧光染色和western blot检测Gn RH1在转基因小鼠下丘脑中的表达。小动物超声仪检测不同性别小鼠心功能变化,western blot法检测雄激素促心肌肥大通路m TOR的磷酸化水平。实验结果:1.FKBP12.6-/-小鼠心脏蛋白检测结果表明,Ca MKⅡ的磷酸化水平与野生型小鼠无差异,雄性小鼠MCIP1.4表达上调,雌性小鼠MCIP1表达上调,表明雄性小鼠Ca N活性增强,雌性小鼠Ca N活性被抑制。2.FKBP12.6-/-雄性小鼠睾丸摘除后不发生心肌肥大,表明雄激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中起重要作用。FKBP12.6-/-敲除小鼠性激素水平上调。表明FKBP12.6-/-敲除小鼠下丘脑-腺垂体-性腺轴功能上调。3.FKBP12.6在LβT2表达远高于GT1-7。siRNA干扰FKBP12.6并不影响GT1-7细胞中Gn RH1表达。表明FKBP12.6对下丘脑-腺垂体-性腺轴的调控部位可能在垂体。4.FKBP12.6干扰后LβT2细胞内钙离子浓度上升,Ca N、MCIP1.4、SERCA2、LHβ、Nur77、SF-1等m RNA表达增加,胞浆中Ca N、MCIP1.4蛋白和ERK1/2磷酸化水平,胞核Nur77、NFAT3、Pin1蛋白和Pin1磷酸化水平上调。表明FKBP12.6缺失通过Ca N/NFAT3途径调控垂体LHβ和FSHβ的转录表达。5.CD38干扰后GT1-7细胞GnRH1 mRNA的表达增加,Sirt1抑制剂EX527可逆转CD38干扰后Gn RH1前体蛋白及其转录因子Otx2表达的上调。表明CD38通过改变Sirt1活性调控Gn RH1的表达。6.DOX诱导后小鼠下丘脑组织中Gn RH1前体蛋白表达上调,血清中Gn RH1和FSH分泌增加,表明Gn RH1成功在小鼠下丘脑特异性过表达,小鼠超声心动图结果显示雄性转基因小鼠在诱导30天和60天后IVS厚度和左心室重量增加,雌性小鼠无明显改变,表明Gn RH1转基因小鼠发生性别差异性心肌肥大。雄性小鼠心脏m TOR的磷酸化水平上调,表明雄激素促心肌肥大通路m TOR被激活。结论敲除FKBP12.6或CD38基因可分别通过激活脑垂体Ca N/NFAT3或下丘脑Sirt1信号途径,增强下丘脑-腺垂体-性腺轴的功能,进而引起小鼠体内性激素水平上调(如雄激素水平升高,雌激素水平相对降低),导致敲除小鼠性别差异性心血管表型。DOX诱导成年小鼠Gn RH1在小鼠下丘脑特异性表达,可直接导致小鼠产生性别差异性心血管表型如心肌肥大等。因此,我们首次证明,下丘脑-腺垂体-性腺轴的调控改变是产生性别相关心血管表型差异的主要原因。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332;R54

【参考文献】