DNA免疫制备抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的研究

发布时间：2020-05-05 21:29

【摘要】：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp.)在全球有较高的感染率,是唯一种能在胃酸环境下定植的病原菌。H.pylori的定植改变了胃部的酸性环境,并释放毒性物质,诱发一系列慢性甚至恶性胃部疾病。卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin,IgY)可以由特异性受体激发,在鸟类的B淋巴细胞内产生经由血清运送到卵黄当中的天然抗体,IgY可以通过产生被动免疫保护作用对由病原菌、病毒等引发的人畜疾病起到治疗效果。目的选取H.pylori免疫原性强的致病因子黏附素(Hpa A)、尿素酶B亚基(Ure B)、I亚基(Ure I)克隆至真核表达载体。再将克隆的真核表达重组质粒作为抗原,免疫蛋鸡生产制备特异性卵黄抗体(IgY)后检验其生物学活性。为研究与开发针对幽门螺杆菌的预防性保健食品和临床诊断试剂及治疗奠定基础。方法与结果利用PCR技术分别将H.pylori的Hpa A、Ure B、Ure I基因进行扩增,通过双酶切法将目的基因分别克隆至p ET28a(+)和p CMV-tag2B两种质粒上。再分别将重组的质粒转化(或转染)至蛋白表达工程菌和真核细胞中进行目的蛋白的表达;得到具有活性的目的蛋白,经凝胶层析法初步纯化后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达情况以及表达量的大小。结果显示,真核表达与原核表达的蛋白都有良好的特异性免疫反应,说明重组的真核表达质粒具备进行活体免疫的可行性。制备去除内毒素的三种真核表达重组质粒,用p CMV-tag2B-Hpa A、p CMV-tag2B-Ure B、p CMV-tag2B-Ure I以及三种质粒的等比混合物分别免疫蛋鸡,并将纯化后的Hpa A、Ure B、Ure I三种蛋白抗原作为对照组一同进行免疫。收集鸡蛋,水稀释法结合PEG沉淀后再利用DEAE-Sephorose Fast Flow凝胶过滤柱层析纯化后,测定抗H.pylori的特异性卵黄抗体(Hp.-IgY)的生物学活性,Western blot结果各组Hp.-IgY都能与相应的抗原发生特异性结合,有良好的免疫反应性;间接ELISA结果显示DNA免疫蛋鸡所产生的特异性IgY的效价能达到与蛋白抗原免疫蛋鸡所产生的特异性IgY效价水平;凝集实验显示Hp.-IgY与H.pylori能在体外发生凝集沉淀。结论本课题通过以上实验论证了构建Hpa A、Ure B、Ure I基因疫苗的可行性,并通过DNA免疫获得了与传统免疫方式效价接近的特异性的卵黄抗体蛋白,且经检测其具备良好的生物学活性,初步探究了一条简单经济的幽门螺旋杆菌IgY抗体制备途径,为幽门螺旋杆菌的预防性保健食品及临床治疗与诊断试剂的研究开发创造了条件。
【图文】：

示意图,结构对比,示意图

经由血液累积到卵黄当中，并且他们从被免疫母鸡所产鸡应的特异性抗体。而当时这一经典实验并未收到重视，直taak 等人[38]提出“IgY 技术”这一概念。一年后，IgY 技术被的生产和应用[39]。体(IgY) 来自于禽蛋制品产量丰富并且成本低廉，相比较产具有很明显的优势。进一步对其理化性质的研究表明其生物学上，它在动物种系发生学上存在距离的优势, 这些性抗体被大量生产的价值[40]。IgY 的被动免疫功能在抑制有很大潜力, 这一潜力在开发新型药物和功能性食品中开的结构和功能

质粒图谱,引物,组分,程序设定

图 2-2 pET28a(+)和 pCMV-tag2B 质粒图谱Fig.2-2 pET28a(+) and pcmv-tag2b plasmid.PCR 反应体系配置如下组分体积2×Taq Plus Master Mix 25 μL引物 Forward（10μM） 2.0 μL引物 Reverse（10μM） 2.0 μL模板 DNA 1.0 μLddH2O 20 μLTotal 50 μL按以上体系将各组分分别加入到 0.2 mL Ep 管中，用移液枪轻轻吹打混匀后入 PCR 仪，按以下程序设定反应。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】