甲型H1N1流感病毒外层蛋白与抑制剂或抗体的作用机理研究

发布时间：2020-05-06 07:31

【摘要】：甲型流感病毒(influenza A virus)是严重威胁人类健康的病原体之一,一直以来备受疾病防治领域的广泛关注。血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感病毒外层的两个主要糖蛋白,它们在流感病毒的生命周期中起着关键的作用。因HA和NA的特殊功能,二者已成为流感病毒抑制类分子设计的主要靶点。甲型H1N1亚型流感病毒曾引起多次世界范围内的大流行,针对该亚型病毒的新型抑制类分子研究是当前该领域的研究热点。随着实验筛选合成技术以及计算机辅助工具的不断发展,越来越多的以HA及NA为靶点的潜在小分子抑制剂以及广谱中和抗体被发现,这对抗流感病毒药物发展提供了极大的便利。然而,想要更充分地利用这些新型抑制类分子进行新药开发,必须从理论层面深入了解其微观作用机理。但当前理论研究的步伐却远不及新型抑制类分子发现的速度,已知作用机制的抑制分子数目仍极为有限。因此,基于实验筛选结果的更深层次的抑制剂理论机理研究尤为必要。本文将利用分子对接、分子动力学模拟、拉伸分子动力学模拟以及结合自由能计算等多种理论计算方法从分子、原子等角度来研究几种以甲型H1N1流感病毒外层蛋白HA和NA为靶点的潜在抑制剂小分子、以及大分子抗体的微观作用机理。本文具体的研究内容包含以下三个部分:1、一种甲型H1N1流感病毒HA蛋白小分子抑制剂的结合及抑制机制研究在之前的研究当中,Arnab等人利用高通量筛选技术获得了一种名为MBX2329的小分子,该小分子能够通过抑制H1N1亚型流感病毒HA的酸变构,进而破坏病毒膜与细胞膜膜融合的潜力。该小分子的发现对于新甲型H1N1流感病毒抑制剂的开发有着重要的意义,然而该分子与H1N1 HA的动态结合机制及抑制机理尚未得到具体研究。本研究根据实验选取了两种不同的甲型H1N1流感毒株(A/Washington/10/2008 H1N1和A/Florida/21/2008 H1N1)的HA及小分子抑制剂MBX2329为主要研究对象,应用分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算等理论研究方法研究MBX2329在中性条件下与HA的结合机制并探究MBX2329在酸性条件下抑制HA变构的机理。研究表明,在中性条件下,MBX2329可以通过范德华作用力与HA的颈部区稳定结合,这一结合可协助小分子随着HA通过胞饮过程进入胞饮小泡。模拟胞饮小泡内部酸性条件的实验结果表明,MBX2329可在酸性条件下移动到一个新的保守口袋处行使其抑制效力。经分析,MBX2329在酸性条件下的结合可以有效地阻止HA1与HA2的分离,且进一步维持HA2内部长、短螺旋以及Loop环的结构稳定,保护Glu101和Lys50之间的盐桥,进而有效阻止HA三聚体在酸性条件下的解聚行为。本研究考察的新结合口袋残基十分保守,其有潜力成为新的药物设计靶点。研究结果为将来以抑制HA变构为目标而进行的药物设计提供了理论依据。2、一种靶向甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的小分子抑制剂机理研究在之前的研究当中,Wang等人报道了一种潜在NA抑制剂7a,该小分子能够同时抑制A/Puerto Rico/8/34(H1N1)NA(NA_(PR))和A/California/04/09(H1N1)NA(NA_(CA))的活性。然而据结晶实验显示NA_(PR)和NA_(CA)活性中心口袋存在明显的差异。NA_(PR)属于典型的进化枝1 NA,在其活性位点区域具备150空腔这一拓展结构,而09年大流行期间毒株的NA_(CA)活性中心上则缺少这一空腔。小分子7a的这种能够以可观的抑制效果同时抑制两个在结构上存在差异的NA的能力,使我们对其潜在的抑制机制产生了极大的兴趣。为了进一步地探究7a的抑制机理,本章应用分子动力学模拟,拉伸分子动力学模拟,结合自由能计算等理论方法对7a的功能进行了研究。研究表明,7a可以同时以氢键、阳离子共轭等微观作用力结合于上述两种在结构上存在差异的NA活性中心。7a以一种相对舒展的姿势结合在存在150空腔的NA_(PR)活性中心,而7a在与缺少150空腔的NA_(CA)结合时则倾向于结合在活性口袋靠近150-环的一侧。进一步的理论结果显示,7a的环状结构在NA活性口袋的适应方式在很大程度上决定了其结合位置,而7a硼酸结构则负责进一步稳定小分子的结合。由于150空腔的存在,NA_(PR)的活性中心口袋较为宽阔,7a的环状结构可以很容易的与活性中心周围的正电氨基酸残基结合。相比之下,NA_(CA)由于缺少150空腔,其活性口袋较为狭窄,导致7a的环状结构倾向首先与150-环及430-环上暴露的正电残基结合,7a在NA_(CA)活性口袋的适应过程中影响了NA_(CA)局部结构,导致了类150空腔的形成,为7a进一步地与NA_(CA)稳定结合提供了保障。该结果揭示了7a可能存在的广谱结合机制,为以后该类抗流感药物的发展提供了新的理论线索。3、一种靶向甲型H1N1流感病毒HA颈部区的广谱中和抗体的动态抑制机制研究靶向作用物与流感病毒表面蛋白之间的作用机制一直备受关注。治疗性广谱中和抗体的作用机制研究与小分子抑制类药物的研究同样迫切。最近,Wang等报道了一株名为3E1的人源单克隆抗体,通过体内及体外实验证明,3E1能够通过抑制HA蛋白的变构而有效地对抗H1及H5亚型的流感病毒感染。3E1 Fab段与两株H1N1 HA单体的复合物已经在晶体实验中得到,但3E1与HA之间的动态作用机制仍未深入研究。本章将利用同源模建、分子动力学模拟等方法研究广谱中和抗体3E1的动态抑制行为。另外,根据实验显示,HA2亚基第45号残基的I45F突变将会降低3E1对于HA的结合活性,而该突变是如何影响3E1与HA_(I45F)结合的,尚未在理论层面深入考究。因此,在本部分研究中,我们也具体分析了I45F突变对HA_(I45F)-3E1复合物结合稳定性的影响。理论结果表明,3E1的结合可以降低HA2长螺旋上端的扰动;同时3E1能够保护Glu101和Lys50之间的盐桥,维持HA2长短螺旋的稳定,进而抑制长螺旋底部105至107号残基附近的翻转回折。此外,通过对突变体HA_(I45F)与3E1之间的动态行为研究发现,I45F突变会破坏HA2短螺旋与3E1的HCDR3区以及轻链Trp32之间的疏水作用,从而减弱3E1与HA的结合,进而导致3E1抗体重链结合位置下移,同时会完全破坏3E1的轻链与HA的有效接触。上述结果揭示了3E1抗体的作用行为,其可作为提高抗体广谱性设计的依据,为今后以3E1为基础的治疗性抗体改造与设计提供了理论基础。本研究结果对于流感病毒的防治研究具有重大的意义。HA和NA与其抑制类分子微观作用的阐明,可明确特异性抗流感药物的设计思路,指导广谱性中和抗体的改造方向,亦可为流感病毒候选免疫原的设计提供理论线索。
【图文】：

类社会,二十世纪,流感流行,年份

图 1.1 二十世纪以来对人类社会造成较1.1.2流感病毒颗粒的结构与组分成熟流感病毒颗粒的形状毒外壳骨架以及病毒核心新分离出来的流感病毒株毒拥有八段单股的负链丙型流感病毒 RNA 链则为七段二十世纪以来对人类社会造成较大影响的甲型流感流行年份呈球形，其外到内的整体结构分别为病毒包膜毒外壳骨架以及病毒核心。流感病毒颗粒的直径范围在 80 至 120多为丝状。如图 1.2 所示，甲型流感病毒RNA，分别是 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA[14]。流行年份。其外到内的整体结构分别为病毒包膜、病纳米之间，而甲型流感病毒和乙型流感病、M、NS。

流感病毒

二十世纪以来对人类社会造成较病毒颗粒的结构与组分感病毒颗粒的形状以及病毒核心的流感病毒株单股的负链毒 RNA 链则为七段二十世纪以来对人类社会造成较大影响的甲型流感流行年份呈球形，，其外到内的整体结构分别为病毒包以及病毒核心。流感病毒颗粒的直径范围在 80 至 120多为丝状。如图 1.2 所示，甲型流感病毒RNA，分别是 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA[14]。流行年份其外到内的整体结构分别为病毒包纳米之甲型流感病毒和乙型、M
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R373.13

【参考文献】