糖尿病脑病小鼠中胆汁酸代谢及信号通路研究

发布时间：2020-05-07 02:15

【摘要】：目的随着人们对代谢性疾病的广泛关注,已有诸多研究表明在一些代谢性疾病中,胆汁酸以及胆汁酸信号通路已经成为潜在的治疗靶点,例如:糖尿病、肥胖以及胆结石病。糖尿病脑病是糖尿病的一种并发症,是一种复杂的代谢性疾病,伴随着中枢神经和脑功能损伤,表现为认知功能障碍,使得患老年痴呆的风险增加。对糖尿病脑病的发病机制以及临床上的治疗方法已有很多报道,主要包括对脑组织中的各种神经细胞及神经递质的研究,以及临床上采用的中枢神经刺激的治疗方法。但是,至今仍没有胆汁酸代谢在糖尿病脑病的发生和发展过程中的作用的相关报道。所以,本课题的研究目的是在糖尿病脑病这种复杂的疾病模型中探索胆汁酸代谢及其信号通路。有文献表明,糖尿病的发生会导致迷走神经的病变,而迷走神经对于胆汁酸的代谢和信号通路的影响尚没有系统的研究。作为寻找糖尿病脑病的潜在预防治疗靶点的第一步,我们试着探寻迷走神经在胆汁酸体内平衡中的调节作用。方法为了定量检测生物组织和体液中的胆汁酸浓度,进而对生物体内的胆汁酸代谢进行分析,首先建立了简单有效的液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法。该方法经过了线性、稳定性、准确度、精密度、检测线(LOD)、定量限(LOQ)、回收率、基质效应等验证。生物体内组织和体液中胆汁酸的提取采用简便的四步提取法:1.乙腈沉淀蛋白;2.震荡提取;3.离心后上清干燥;4.50%甲醇-水(双蒸水)复溶,样品前处理完成后等待进样检测。糖尿病脑病动物模型的建立采用C57BL/6小鼠,实验组小鼠长期喂养高脂饮食,糖尿病组和糖尿病脑病组小鼠经单次注射链脲霉素(STZ)诱导。模型构建后期,用水迷宫试验(Morris water maze test)判断小鼠疾病阶段,将小鼠分成四组,分别为正常组(NC)、高脂饮食组(HFD)、糖尿病组(unDCD)及糖尿病脑病组(DCD)。模型建立成功后,将小鼠麻醉并收集小鼠肝脏、肠道及结肠。用液相色谱-质谱联用方法(LC-MS)定量测定肝脏和肠道中胆汁酸的浓度;并采用逆转录聚合酶链式反应实时荧光定量技术(RT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测肝脏和肠道中与胆汁酸相关的基因表达情况;采用定量PCR技术检测分析结肠内容物中细菌总量的变化和各类细菌百分比含量的变化。为了探究迷走神经对胆汁酸代谢以及信号通路的调控作用,本研究继而建立了大鼠(Wistar)膈下迷走神经切断模型,模型构建成功后,对大鼠进行麻醉,收集胆汁、血液、肝脏、肠道以及结肠。采用液相色谱-质谱联用技术定量测定胆汁、肝脏以及血清中胆汁酸浓度。并采用逆转录聚合酶链式反应实时荧光定量技术和蛋白免疫印迹技术检测肝脏和肠道中胆汁酸相关的基因表达情况。结果糖尿病脑病小鼠模型建立过程中,观察到高脂饲料喂养持续五周后,四组小鼠中的体重差异显现,高脂饮食组(HFD)小鼠体重相比于正常饮食组(NC)小鼠体重显著增加了19%,然而糖尿病(unDCD)和糖尿病脑病(DCD)组小鼠体重却有所减轻,尤其糖尿病脑病组小鼠体重比正常组小鼠显著下降了12%。饲养第六周时,三组实验组小鼠的空腹血糖水平相比正常对照组升高,糖尿病组和糖尿病脑病组小鼠血糖相比于高脂喂养组小鼠血糖均显著升高了约1.3倍。血脂检测中,实验组小鼠的总胆固醇含量相比正常组显著升高;甘油三酯的含量在糖尿病脑病小鼠中显著升高,在糖尿病小鼠中升高但无统计学意义;相比正常组,低密度脂蛋白含量在糖尿病和糖尿病脑病小鼠中均显著性升高,高密度脂蛋白在糖尿病小鼠中显著升高,在脑病小鼠中增加不明显(约44%)。在用于观察小鼠学习及记忆能力的水迷宫实验中,得到如下结果:在为期五天的观察中,从第三天开始小鼠的记忆能力差异显现,糖尿病脑病组小鼠逃避潜伏时间显著长于其它三组小鼠;首次到达平台的时间显著高于正常组,相比糖尿病组小鼠慢了约3s;穿越平台的次数相比高脂饮食组和糖尿病组减少一次,相比正常组小鼠减少四次。糖尿病脑病模型研究中胆汁酸浓度定量检测的结果显示,同正常组(NC)以及高脂饮食组(HFD)相比,在糖尿病(unDCD)和糖尿病脑病(DCD)小鼠的肝脏和肠道中总胆汁酸的含量均明显升高,尤其在糖尿病脑病小鼠中总胆汁酸的升高存在统计学差异。糖尿病小鼠肝脏中总胆汁酸的升高主要是由于如下几类胆汁酸含量的增加引起的,TMCA增加了259%,TMDCA增加了153%,TCDCA增加了342%,然而几种非结合型胆汁酸显著降低,CA降低60%,βMCA降低38%,DCA降低80%,导致肝脏中非结合型胆汁酸总量降低了55%。糖尿病脑病小鼠肝脏中不仅总胆汁酸含量升高,初级胆汁酸和结合型胆汁酸的总量也分别升高,有几种胆汁酸浓度变化明显,TMCA增加了212%,TCA增加了102%,TCDCA增加了279%,CA增加了39%,CDCA增加了46%,isoCDCA增加了403%。糖尿病脑病小鼠肠道中初级胆汁酸和结合型胆汁酸的总量同样显著升高,TMCA,TCA,TUDCA,TCDCA,TDCA,和isoCDCA显著增加,CA和αMCA显著降低。和正常组(NC)小鼠相比,高脂饮食组(HFD)小鼠中肝脏和肠道总胆汁酸浓度均无明显变化,虽然肝脏中总胆汁酸的含量无明显变化,但是个别的胆汁酸含量产生了明显变化,TLCA增加了486%,TDCA增加了101%,CA降低了36%,CDCA增加了83%,DCA增加了81%,βMCA降低了34%,MDCA增加了478%,isoCDCA增加了732%。糖尿病脑病小鼠中,肝脏中胆汁酸浓度异常增加,而肝细胞胆汁酸外排转运体Ostα,Ostβ,和Mrp4基因明显上调,说明这是一种机体自身的反馈调节机制。此外,糖尿病脑病小鼠肝脏中胆汁酸合成酶Cyp7a1,Cyp8b1,Cyp7b1和Cyp27a1的mRNA都显著性降低,Cyp7a1的蛋白水平也有着显著下降。糖尿病脑病小鼠肠道的Fxr-Fgf15信号通路被激活,Fgf15的mRNA及蛋白水平均显著上调,Fxr-Fgf15信号通路的激活可能是导致肝脏中胆汁酸合成限速酶Cyp7a1被抑制的主要原因。结肠内容物中细菌的检测中,糖尿病脑病组小鼠细菌总量明显减少,其中三种细菌Bacteroidetes,Tenericutes,和β-proteobacteria显著降低。并且,肠细胞中胆汁酸重吸收转运体Asbt,Ostα和Ostβ的mRNA水平显著升高。次级胆汁酸在肠道中形成,细菌菌种Bacteroidetes中存在着细菌胆酸盐水解酶(BSH),这种酶使得结合型胆汁酸水解脱去甘氨酸和牛磺酸侧链,最终使得结合型胆汁酸水解生成非结合型胆汁酸。Asbt是胆汁酸在肠道中进行主动吸收的主要转运体(钠离子依赖性转运体),位于回肠顶膜中,负责将肠道内容物中的胆汁酸主动转运到肠细胞中,细胞内胆汁酸与肠道胆汁酸结合蛋白(Ibabp)结合并被携带到肠道基底外侧膜上,基底膜上存在胆汁酸转运蛋白Ostα和Ostβ,负责将肠细胞中的胆汁酸转运到肝门静脉中,Asbt,Ibabp,Ostα和Ostβ构成肠道中胆汁酸重吸收的转运系统。细菌Bacteroidetes的降低和肠道重吸收转运体的增加可能是肝脏中结合型胆汁酸增多的主要原因。我们还发现,和正常组小鼠相比,其它三组小鼠肝脏中四羟基胆汁酸浓度显著降低,导致这个现象的一部分原因可能是因为胆汁酸羟化酶Cyp3a11的下调。我们还检测到在糖尿病及糖尿病脑病小鼠的肝脏中,胆汁酸硫酸化酶Sult2a1的mRNA水平显著增加,说明胆汁酸硫酸化可能是在糖尿病脑病发展过程中机体降低胆汁酸毒性的一个机制。实验大鼠进行膈下迷走神经切断后,相比于假手术组大鼠体重的逐天增加,手术组大鼠体重几乎保持不变。手术后第七天时,手术组大鼠体重相比假手术组降低了约19%,这是早期临床上用这种手术治疗肥胖的主要原因。两组大鼠的体重/肝重值、血液谷丙转氨酶(ALT)含量、血液总胆红素(TBIL)含量均无变化,说明该手术模型没有产生肝脏损伤。手术后第七天时对胆汁流速进行了监测,发现迷走神经切断大鼠的胆汁流速显著高于假手术组大鼠,一小时内迷走神经切断大鼠的胆汁流量相比假手术大鼠高了约18%。大鼠迷走神经切断手术模型胆汁酸分析中,我们发现在迷走神经切断手术大鼠胆汁、血清和肝脏中都存在非结合型胆汁酸及次级胆汁酸浓度明显升高的现象,这也导致了在这些组织和体液中胆汁酸的疏水性显著增加。胆汁中,结合型胆汁酸TMCA降低了36%,TMDCA增加了1.2倍,GCDCA增加了4.9倍,GDCA增加了6.5倍,GLCA则增加了8.1倍;几乎所有的非结合型胆汁酸均有所升高,如CA升高了5倍,ωMCA升高了4.8倍,βMCA升高了3.9倍,CDCA升高了4.2倍,7-oxo-HDCA升高了63倍,12-oxo-CA升高了9.4倍。此外,四羟基胆汁酸12α-OH-ωMCA、12α-OH-βMCA、6α-OH-CA均升高了10-15倍,硫酸化胆汁酸UDCA-3S升高了10倍,CDCA-3S升高了3.7倍。血清中,主要的结合型胆汁酸TMCA、TCA、TUDCA、THDCA、TCDCA和TDCA没有发生变化,但甘氨酸结合型胆汁酸GCDCA增加1.1倍,GDCA增加了1.3倍;非结合型胆汁酸除βMCA、UDCA及LCA外均有显著增加。肝脏中,只有TMDCA(升高1.6倍)、THDCA(降低53倍)、GCDCA(升高3倍)、UDCA(升高67倍)和iso-CDCA(升高1.1倍)五种胆汁酸的变化存在显著性,这导致非结合型胆汁酸的总量升高了约2倍,但统计学上没有显著性差异。迷走神经切断后,肝脏胆汁酸合成经典途径中胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1显著降低,胆汁酸合成替代途径中胆汁酸合成关键酶Cyp7b1同样降低但无显著性差异,在两种合成途径中均起作用的胆汁酸合成酶Cyp27a1却没有变化。肝脏中胆汁酸调控信号通路中Fxr和Shp的基因和蛋白水平均无变化,说明迷走神经切断大鼠肝脏的Fxr-Shp信号通路不是抑制胆汁酸合成酶的原因。我们发现,肠道中胆汁酸调节信号通路中Fgf15的基因和蛋白水平均显著性增加,肠道Fxr-Fgf15信号通路被激活,可见Cyp7a1等胆汁酸合成酶的降低是由于受到了肠道Fxr-Fgf15信号通路的调节。再者,由于肠道中Fxr-Shp信号通路被激活,导致肠道胆汁酸重吸收转运体Asbt被抑制。我们又发现肠道膜结构中的紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin的蛋白水平显著降低,这可能是引起血液和胆汁中非结合型胆汁酸显著增加的原因。对于胆汁酸转运体的检测,肠道中除了胆汁酸重吸收转运体Asbt显著下调外,肠道Ostα和Ostβ没有受到影响,肝脏中几种主要胆汁酸转运体均没有显著性变化。结论我们的研究表明,糖尿病脑病小鼠中肠道细菌的改变使得肠道和肝脏中胆汁酸增多(主要为结合型胆汁酸和初级胆汁酸),这激活了肠道Fxr-Fgf15信号通路,通过负反馈调节机制抑制了肝脏中胆汁酸合成酶Cyp7a1,进而抑制肝脏中胆汁酸的合成。同时我们的研究表明迷走神经受损的大鼠体内非结合型胆汁酸浓度异常升高,激活了肠道中Fxr-Fgf15信号通路,抑制了肝脏胆汁酸合成限速酶Cyp7a1,从而证实了迷走神经参与了胆汁酸代谢的调节及胆汁酸信号通路的调控。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R747.9;R-332

【相似文献】