乳酸杆菌S层蛋白对HT-29细胞TLR4-MyD88-NF-κB信号通路及凋亡的影响

发布时间：2020-05-07 10:33

【摘要】：S-层蛋白是位于一些细菌细胞壁外层的一种蛋白成分。乳酸杆菌的S-层蛋白对其发挥益生功能具有重要作用。许多研究证实乳酸菌定殖于宿主肠道中,能够对宿主的免疫系统发挥重要的调节作用。目前关于S-层蛋白对宿主细胞TLR4-My D88-NF-κB信号通路的影响的研究较少,所以本课题以脂多糖(LPS)作为炎性刺激物,研究从Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L两种乳酸杆菌上分离的S-层蛋白对HT-29细胞的TLR4-My D88-NF-κB信号通路的影响。本研究采取5 mol/L的Li Cl提取S-层蛋白,并利用1 mol/L的Li Cl通过盐析的方法来纯化粗提蛋白,SDS-PAGE检测表明两株菌均在45 k Da处有单一条带。调整S-层蛋白浓度作用细胞,经WST-8实验最终确定其作用浓度为150μg/m L,活菌体与热灭活菌体的浓度为107 cfu/m L和108 cfu/m L,脂多糖(LPS)与细胞作用的最佳浓度是10μg/m L,作用时间为6 h进行后续实验。WST-8实验证实了在作用时间为6 h时,两种S-层蛋白、活菌体与热灭活菌体能够抑制LPS对HT-29细胞增殖的影响,并且预防组具有明显的效果。通过对细胞上清液中NO含量的检测,证明两种S-层蛋白、活菌体、热灭活菌体能够显著降低LPS引起的细胞过度分泌NO。通过ELISA测定细胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平,进一步通过Western Blot法对HT-29细胞的TLR-My D88-NF-κB信号通路中关键酶从蛋白水平进行研究。结果表明S-层蛋白、活菌体和热灭活菌体均能抑制炎性因子IL-10和IL-1β,并且对细胞中关键蛋白TLR2/4、My D88、TRAF6、IκB-α和NF-κB-p65进行调节,进而对宿主细胞的免疫作用进行调控。流式细胞术检测HT-29细胞凋亡情况,证实两种S-层蛋白均能够调节LPS导致的细胞周期紊乱的状态,并对LPS诱导的凋亡细胞大量增加的情况进行抑制,进一步证实了S-层蛋白能通过对LPS的抑制作用进而保护宿主细胞。研究也表明S-层蛋白、活菌体、热灭活菌体能够通过拮抗细胞Caspase-1的活性,进而抑制LPS引起的细胞炎性,通过对Caspase-3、Caspase-9活性的降低,进而减少LPS引起的细胞凋亡。
【图文】：

S-层,蛋白,乳酸杆菌

对菌株M5-L及Q8-L的S-层蛋白采用5 mol/L LiCl进行了粗提取，粗提取的S-层蛋白通过1 mol/L LiCl进行纯化。用SDS-PAGE检测S-层蛋白的提取和纯化情况，见图3-1。如图3-1所示，在45 KDa处均能看见清晰的电泳条带，这与文献中描述的S-层蛋白的分子量范围一致。对比经1 mol/L LiCl纯化前后的S-层蛋白，，条带1、2与5、6具有专一的条带，纯化效果较好。可以进行后续实验。国内外研究使用NaOH、LiCl、溶菌酶、盐酸胍、pH分别为4.0和7.3的PBS对乳酸杆菌的S-层蛋白进行提取，结果表明，5 mol/L LiCl提取的S-层蛋白含量

细胞存活率,S-层,乳酸杆菌,细胞活性

图 3-3 不同浓度 LPS 对细胞存活率的影响Fig. 3-3 Effect of different concentrations of LPS on cell viability同浓度的 S-层蛋白对 HT-29 细胞活性的影响分别研究了浓度为50、100、150、200 μg/mL的乳酸杆菌M在6、12、18、24 h处理HT-29细胞后，对其活性的影响。b)
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R371

【参考文献】