小鼠皮肤角质细胞特异性敲除Cdc42对皮肤毛囊发育和创伤愈合的影响

发布时间：2020-05-07 17:21

【摘要】：毛发是皮肤重要的附属结构,在个体中分布很广,几乎遍布全身。它除增加信息交流和美观功能外,还具有具有防御、保护的作用。毛发位于皮下的部分被称为毛囊,毛囊的组成和功能较为复杂,目前有研究认为:毛囊不仅能调控毛发的生长,其内的干细胞还参与皮肤表皮细胞的更新和修复。毛囊是具有周期性生长特性的一种特殊器官,其周期分为生长期、退化期和静止期。在静止期,毛囊细胞受到某些因素的刺激,会再次进入生长期。通常毛发的生长和其周期变化涉及一系列多能上皮干细胞与其邻近的间充质细胞的相互作用,从间充质细胞中发出的活化信号指导多能干细胞的迁移和分化,从而维持毛囊生长及其周期推进,如此周而复始在哺乳动物的整个生命期间循环往复。毛发的维持是毛囊以一种干细胞依赖的方式而进行的周期性再生。其周期性自我更新以及生长依赖于毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs)周期性增殖和分化。如果毛囊各周期转换中的任何一个环节出现问题,就可能会影响毛囊的生长,进而出现毛囊相关疾病,例如脱发、斑秃等。毛囊干细胞是毛囊中的原始细胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge区,也是皮肤干细胞的所在地之一。其通过自我更新维持毛囊周期循环、表皮新陈代谢,有文献认为它还参与了皮肤创伤愈合,能源源不断地为表皮基底层提供干细胞。目前,bulge区是毛囊干细胞主要栖息地的学说已经得到普遍认同。Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白中的重要成员,体内的Cdc42有两种形式,即GDP结合的无活性状态与GTP结合的活性状态。Cdc42在细胞信号转导通路中具有分子开关作用。活化的Cdc42通过作用于细胞内一系列下游效应底物来影响细胞的生长、分化、凋亡和细胞周期等一系列重要生命现象,其最重要的功能是调节肌动蛋白细胞骨架重组。近期研究发现,小G蛋白Rho家族成员对角质形成细胞的增殖、分化和凋亡具有重要调控作用。本课题组前期研究揭示RhoA可以通过MEKK1/JNK信号通路调控角质形成细胞的增殖与分化,促进皮肤创伤愈合。我们利用引进的Cdc42Loxp/Loxp小鼠和K5/Cre~+小鼠,依据Cre/loxp重组酶系统原理(1)建立皮肤角质细胞特异性Cdc42基因敲除小鼠。(2)探讨Cdc42对皮肤及毛囊发育的影响。(3)进一步探讨Cdc42对皮肤创伤愈合的影响及可能参与的相关信号机制,从而为研究和治疗脱发相关疾病及皮肤的创伤修复作用及机制提供理论基础。第一章皮肤角质细胞特异性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立及对小鼠毛囊干细胞的影响研究背景和目的由于以往对Cdc42的研究大多局限于细胞水平,后发现Cre/loxp重组酶系统后,实现了在动物体内进行条件性基因敲除,即实现目的基因在动物体内特定组织及特定时间内的敲除。目前,条件基因敲除动物已经成为用于研究某个特定基因在动物体内特定部位功能的较好的动物模型。Cre/loxp条件性基因敲除技术是目前国际上最先进的基因敲除技术,广泛用于动物体内目的基因作用的研究。角蛋白5 (keratin5,K5)是皮肤表皮层的角质细胞表达的一种角蛋白。正常情况下,K5和K14二者成对表达,是角质形成细胞分化的标志物之一。本研究选用角蛋白5(K5)基因为启动子,用它引导和限定Cre重组酶基因在角质细胞中表达,以获得皮肤角质细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,为应用Cre/loxp系统研究目的基因在皮肤的发生、发育等及皮肤附属器的形成和功能中的作用创造条件。毛发由毛囊生成,毛囊细胞呈周期性生长,如果毛囊各周期转换中的任何一个环节出现问题,就可能会影响毛发的生长,进而出现毛发相关疾病。毛发的维持是毛囊以一种干细胞依赖的方式而进行的周期性再生。其周期性自我更新以及生长依赖于毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs)周期性增殖和分化。毛囊干细胞是毛囊中的原始细胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge区,有文献认为bulge区也是皮肤干细胞的所在地之一。本研究利用Cre/loxp系统的条件性基因敲除原理为理论基础,利用Cdc42Loxp/Loxp转基因小鼠和K5-Cre转基因小鼠,构建皮肤角质细胞特异性Cdc42基因敲除小鼠,探讨Cdc42在毛发周期循环以及对毛囊干细胞的生物学功能影响的作用。研究方法1.利用Cre/loxp重组酶系统,将Cdc42loxp/loxp小鼠和K5-Cre~+/-转基因小鼠进行杂交,其F1代小鼠中基因型分别为Cdc42loxp/+/-K5-Cre~+和Cdc42loxp/+/-K5-Cre-。而后利用 Cdc42lopx+/-K5-Cre~+/-小鼠与 Cdc42loxp/loxp 小鼠杂交,其后代获取1/4比例在角质细胞上敲除Cdc42的小鼠,简称KO小鼠,基因型为Cdc42loxp/loxp/-K5-Cre~+;获取1/2比例Cdc42未敲除(野生型)小鼠,简称 WT 小鼠,基因型为 Cdc42loxp/+/K5-Cre-或 Cc42loxp/loxp/-K5-Cre-。通过PCR方法和Cdc42免疫组织化学方法进行基因水平和蛋白水平鉴定。按照准确的日龄观察出生后的KO小鼠和WT小鼠发育及皮肤和毛囊的大体发育;取出生后24天(P24天)～出生后70天(P70天)的KO小鼠和WT小鼠皮肤,将取材的皮肤放入4%多聚甲醛中固定、石蜡包埋、切片和染色。2.检测指标:(1)大体观察:大体观察KO小鼠和WT小鼠皮肤和毛发的外观和完整性,重点观察毛发的周期性变化差异;(2)组织形态:利用HE染色观察处于毛发生长周期不同阶段KO小鼠和WT小鼠毛囊组织的变化及差异;(3) KO小鼠和WT小鼠在毛发生长发育有差异的时间点进行毛囊干细胞表面标记物K15的检测和比较,以明确皮肤角质细胞Cdc42基因敲除对毛囊干细胞维持和稳定的影响;(4)利用脱毛诱导刺激毛囊干细胞增殖实验,检测Cdc42基因敲除对毛囊干细胞动员和增殖的影响。研究结果:1. PCR基因鉴定,K5-Cre~+为667bp特异条带,Cdc42loxp/loxp为700bp特异性条带,WT为600bp特异性条带。K5-Cre~+且Cdc42loxp/loxp的小鼠为KO小鼠,基因型为Cdc42loxp/loxp-K5-Cre~+。皮肤表皮细胞的Cdc42免疫组化染色,未见KO小鼠皮肤角质细胞内Cdc42蛋白的表达,说明成功构成皮肤角质细胞Cdc42基因敲除小鼠。2.大体观察结果:KO小鼠体型、大小及皮肤完整性等与WT小鼠比较无差别。P49天以前KO小鼠与WT小鼠相比毛发在萌出、萌出后的外观、密度、长度方面无差异。但P49天后KO小鼠出现进行性由头端向尾端的脱毛,至P64天左右,与对照WT小鼠相比,全身毛发明显稀疏,之后无再生迹象,毛发周期性循环消失。3.组织形态观察:KO小鼠出现脱毛表型后,其毛发的周期性循环消失,永久停留在静止期。4.指标检测:免疫组化K15检测发现:在P49天后,KO小鼠皮肤毛囊干细胞(bulge区)明显减少甚至耗竭消失。KO小鼠毛囊从第二个静止期无法正常进入第三个生长期,KO小鼠毛囊干细胞的自然增殖能力减弱甚至消失。脱毛刺激后,KO小鼠毛囊干细胞动员能力明显减弱甚至消失;脱毛后10天,KO小鼠毛干萌出障碍。研究结论1、成功构建皮肤角质细胞特异性Cdc42基因敲除小鼠,并发现:Cdc42基因敲除小鼠毛发在出生后49天逐渐出现进行性脱落,毛发周期性循环消失。2、角质细胞特异性Cdc42基因敲除小鼠在出生后49天,K15标记的毛囊bulge区干细胞逐渐缺失,证明:Cdc42对毛囊干细胞的维持有促进作用。3、伴随着K15标记的毛囊bulge区干细胞的缺失,Cdc42基因敲除小鼠毛囊干细胞的自然增殖和刺激后增殖能力减弱,毛发无法再生。说明:Cdc42对毛囊干细胞的动员和增殖能力有促进作用。第二章角质细胞Cdc42基因敲除对小鼠皮肤创伤愈合的影响研究背景和目的皮肤是机体最大的器官,其首要功能是将机体组织隔绝外界环境起到保护屏障的作用。由于创伤、烧伤、感染、肿瘤和代谢疾病等造成的皮肤损伤在临床上十分常见。皮肤的创伤修复也是目前研究的热点。皮肤创伤愈合是个非常复杂的过程,涉及多种细胞、多个信号机制参与。愈合包括表皮和真皮的再生,表皮再生即是皮肤再上皮化(re-epithelialization)。创伤愈合过程中创口的再上皮化过程非常重要,上皮化延迟会导致伤口纤维化加重,产生明显瘢痕组织。再上皮化过程中,主要由创口周围表皮基底层表皮干细胞及创口附近表皮的附属器中的表皮干细胞向伤口分化、增殖进行修复。近年来,越来越多的研究倾向于研究再上皮化过程中毛囊干细胞发挥的作用,甚至有研究认为,毛囊干细胞强大的分裂增殖潜能为干细胞移植带来了希望。创伤的愈合过程是人体最复杂的生物过程之一,在人体受到各种伤害之后,各种各样的生物信号途径迅速激活并在此修复过程中发挥不同的作用。如:丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是介导细胞生物学应答的重要信号系统。JNK, ERK, p38是MAPK家族主要成员,调节一系列生理病理生物学活动。Wnt信号通路与皮肤的生长发育、毛囊的周期再生以及创面的功能修复等生物学过程均有密切关系。研究证明Wnt信号途径的激活是对创伤刺激的一种特殊反应。而β-catenin是Wnt信号通路的关键作用因子。角质细胞Cdc42基因敲除后导致小鼠出现一系列毛囊发育障碍,包括进行性脱毛,毛囊周期性循环消失,毛囊干细胞缺失。为进一步探讨皮肤角质细胞Cdc42基因敲除对皮肤创伤修复的影响以及由于Cdc42基因敲除造成的毛囊发育异常尤其是毛囊干细胞的异常对皮肤创伤修复的影响及其作用机制,我们进行了皮肤创伤修复实验。研究方法1.分组:Control组(野生型小鼠,WT小鼠)2. 实验组(角质细胞Cdc42基因敲除小鼠,KO小鼠)创伤模型:7-8周龄Cdc42基因敲除小鼠和同窝出生的野生型小鼠,背部右侧制作1cm× 1cm的正方形切口;3.检测指标:(1)组织形态:术后第3, 5, 7, 9,11天取材,分别取伤口周围0.5cm范围内的组织,HE染色观察伤口再上皮化;(2)巨噬细胞浸润:术后第3, 5, 7, 9,11天取材,石蜡切片,免疫组化检测巨噬细胞标记物F4/80的表达,并进行统计分析;(3)肉芽组织内新生血管的数量:术后第3,5, 7, 9,11天取材,石蜡切片,免疫组化检测血管内皮细胞标记物CD31的表达,并进行统计分析;(4)胶原的染色:术后第5, 7, 9,11天取材,石蜡切片,Masson三色染色检测伤口部位胶原的表达;(5)角质形成细胞的增殖和分化:术后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蜡切片,免疫组化检测角质形成细胞进入增殖状态标记物K6和分化标记物K1的表达,并进行统计分析;(6)再上皮化过程中细胞增殖状态:术后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蜡切片,免疫组化Brdu标记检测新生表皮中的细胞增殖状态和创口周围的毛囊组织中细胞增殖,并分别进行统计分析;(6) MAPK信号通路相关信号分子p-ERK,p-JNK,p-P38, p-ELK的表达情况,及统计学分析。(7)Wnt信号通路的关键信号分子β-catenin,及粘附连接分子E-cadeherin的表达检测。研究结果:1.组织形态观察创面愈合速度:在光镜水平观察伤口再上皮化过程,HE染色可见:术后第3天WT组伤口边缘角质形成细胞增殖明显且已经开始向伤口中心迁移形成上皮带(即再上皮化),KO组仅在伤口周围出现角质形成细胞增殖反应,迁移形成上皮带并不明显。术后第5天WT组伤口周围角质形成细胞增殖形成细胞层数更多,迁移速度(即再上皮化速度)快于KO组,差异有显著性;术后第7天WT组伤口已经完成再上皮化,而KO组伤口部位到创后第9天才完成再上皮化,该结果提示角质细胞敲除Cdc42延缓了创口角质形成细胞的再上皮化,使得创面延迟愈合。2.检测指标结果:(2)巨噬细胞浸润:经免疫组化检测巨噬细胞标记物F4/80的表达,并进行统计分析,可见创后第3天和第5天KO组F4/80阳性细胞数显著多于WT组(P≤0.05); (3)肉芽组织内新生血管内皮细胞的数量,免疫组化检测血管内皮细胞标记物CD31的表达,统计分析,可见创后第5天、7天和9天创面新生血管数KO组与WT组差异无显著性;(4)胶原的染色:Masson三色染色检测伤口部位胶原的表达,可见KO组胶原的合成较WT组少,分解较WT组慢;(5)角质形成细胞的增殖和分化:免疫组化检测角质形成细胞进入增殖状态标记物K6和分化标记物K1的表达,并进行统计分析,可见K6的表达在创后第3, 5, 7天KO组显著低于WT组(P≤0.05); K1的表达在创后第5, 7天KO组显著低于WT组(P≤0.05);(6)再上皮化过程中细胞增殖状态:免疫组化Brdu标记检测新生表皮中的细胞增殖状态和创口周围的毛囊组织中细胞增殖,并分别进行统计分析,可见新生表皮和创口周围的毛囊组织中增殖细胞Brdu阳性细胞数在创后第3,5, 7天KO组显著少于WT组(P≤0.05); (6) MAPK信号通路相关信号分子p-ERK,p-JNK, p-P38, p-ELK的表达情况,及统计学分析,可见在创缘新生表皮中p-ERK信号KO组显著少于WT组(P≤0.05),其下游信号p-ELK的表达与p-ERK信号表达基本一致(P≤0.05)。(7)Wnt信号通路的关键信号分子β-catenin,及粘附连接分子E-cadeherin的表达检测,创后第3, 5,7天KO组可见胞质高浓度表达的β-catenin,与β-catenin共同构成粘附连接的E-cadeherin的表达,与胞膜表达的β-catenin 一致。研究结论1、皮肤角质细胞Cdc42的敲除延缓了皮肤创伤愈合,尤其是延迟了创伤愈合过程中的再上皮化速度,这可能跟角质细胞Cdc42基因敲除后,小鼠在第二个生长期后毛囊bulge区毛囊干细胞的缺失有关。2、在信号机制方面角质细胞Cdc42的基因敲除后,创伤修复再上皮化过程的延迟可能由MAPK信号家族中的ERK-ELK信号通路的介导完成。3、活化的Wnt/β-catenin信号通路也可能参与抑制了毛囊干细胞向角质形成细胞方向的分化,延缓了创伤修复中再上皮化速度。
【图文】：

基因型鉴定,转基因小鼠

鼠生长发育未见异常，全身毛发为黑色，无活动及外观异常，具有生育力。ＰＣＲ逡逑方法基因型鉴定结果为Ｋ５－Ｃｒｅ＋小鼠可见一条６６７ｂｐ特异条带，Ｋ５－Ｃｒｅｖｊ、鼠ＰＣＲ逡逑结果为阴性，未见特异性条带。ＰＣＲ方法基因型鉴定结果见：图１－１，逡逑ｆｌ＂邋Ｉｆ逡逑图１－１邋Ｋ５－Ｃｒｅ转基因小鼠的基因型鉴定。逡逑Ｆｉｇ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｋ５－Ｃｒｅ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．２逦纯合子转基因小鼠的繁殖、生长发育及基因鉴定情况逡逑Ｃｄｃｕｌｏｘｐ／ｂｘｐ纯合子转基因小鼠繁殖顺利，其子代全身毛发均为黑色，外观及活逡逑动正常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鉴定结果为ＣｄＣ４２ｌ＜）ｘｐ／ｌ°ｘｐ纯合子小鼠可逡逑见７００ｂｐ邋—条特异性条带；杂合子小鼠可见６００ｂｐ和７００ｂｐ两条特异逡逑性条带。ＰＣＲ方法基因型鉴定结果见：图１－２逡逑２０逡逑

电泳图,小鼠,基因型,杂合子

逡逑图１－２邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ转基因小鼠的基因型鉴定逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．３邋ＷＴ小鼠的生长发育及基因鉴定情况逡逑ＷＴ邋小鼠基因型为和邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－。ＷＴ邋小鼠出逡逑生后能够正常发育长大，成鼠全身毛发黑色，体型、大小、外观及活动均未见逡逑异常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鉴定结果见图１－３Ａ逡逑图１－３ＡＷＴ小鼠的基因型逡逑Ｆｉｇ邋１－３Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ｍｏｕｓｅ逡逑ＰＣＲ电泳图中１－８为同窝出生的小鼠编号，其中６号小鼠是基因型为逡逑？的邋ＷＴ邋小鼠，，５，７，８邋号小鼠是基因型为邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－逡逑的ＷＴ小鼠逡逑１．３．１．４杂合子小鼠的生长发育及鉴定情况逡逑杂合子小鼠基因型为Ｃｄｃ４２１°ｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ＋，其表皮细胞Ｃｄｃ４２仅被半敲除，逡逑仍能够表达Ｃｄｃ４２。杂合子小鼠出生后能够正常发育长大。杂合子小鼠全身毛发逡逑黑色，体型、大小、外观及活动均未见明显异常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基逡逑因型鉴定结果见图１．３邋Ｂ：逡逑瞀：．逡逑２１逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R334.5

【参考文献】