下丘脑orexin区主要神经元分布及发育变化的形态学研究

发布时间：2020-05-08 14:30

【摘要】：下丘脑(Hypothalamus,HP)作为间脑的主要组成部分,是一个高度异质性的区域,其由不同的核团组成,可以接收大量内外感觉信息,发挥着非常重要的生理功能,如参与本能行为,睡眠-觉醒周期和摄食行为的调控。功能依赖于细胞网络结构的协调输出,同时环路的异质性、细胞结构的复杂性、行为状态的多样性会导致功能的差异,其中细胞类型的多样性更是构成环路的最基础元素。构成HP区域细胞网络结构的主要神经元有食欲素(orexin/hypocretin)神经元、黑素浓集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)神经元、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神经元和谷氨酸能(Glutamatergic,Glut)神经元等。这些神经元共同分布在外侧下丘脑区(lateral hypothalamus area,LHA)、穹隆周区(perifornical area,PeF)、未定带(zona incerta,ZI)、背内侧下丘脑(dorsomedial hypothalamus,DMH)等区域,有着紧密的相互联系,共同维持HP的稳态功能。我们重点关注HP以orexin神经元为主的细胞分布,因此,我们将全部orexin神经元在HP分布的立体范围,定义为HP-orexin区,主要探究该区域内的主要神经元分布模式。在二维空间上已有研究对orexin和MCH两种神经元的整体分布进行过描述和统计,但是对整体及各亚脑区的具体三维分布模式及形态学特征尚缺乏直接有力的证据,向外投射的orexin神经元群组如何分布也尚未知晓,且关于GABA与Glut神经元在HP-orexin区内的共同分布模式也尚不清楚。在orexin和MCH的发育表达相关研究中发现,大鼠orexin mRNA和蛋白质在胚胎发育第12天(embryonic 12,E12)即可检测到,而MCH mRNA和蛋白质在E16才能检测到;小鼠的orexin神经元胚胎发育与大鼠基本相一致,而MCH神经元在大鼠和小鼠中的分布位置和发育情况则有所差异:在大鼠中,MCH神经元发生的峰值与orexin神经元发生的峰值相比略晚;在小鼠中,MCH和orexin神经元发生的峰值相一致。但是以小鼠为研究对象,针对出生后orexin与MCH神经元发育是否同步,在发育至成年的过程中神经元有没有发生亚群的迁移以及数量的增多或减少,与成年数量、大小、分布范围在何时达到一致等问题仍没有详细确切的结论。因此,本研究拟采用免疫荧光、连续成像、三维重建和形态特征测量的方法重构orexin与MCH神经元的整体和亚脑区三维结构,同时探究各组分布特点和形态特征,及与GABA、Glut能神经元之间的相互位置关系;随后对orexin和MCH神经元不同发育阶段的三维分布模式和形态学变化进行详细探究。主要结果有:1.成年orexin与MCH神经元在HP整体和不同亚脑区具有不同三维分布模式为了详细分析HP-orexin区的两种神经元分布模式,我们依照小鼠Allen脑图谱进行比对,将orexin和MCH神经元还原到图谱脑区中,进行不同亚脑区的神经元三维重建,并对数量、神经元大小、径向分布距离等形态特征进行测量统计。结果显示:成年orexin神经元主要分布在LHA,形成一个立体的中心区域,MCH神经元以包绕模式分布在orexin神经元的周围,核心部分仅有少量与orexin神经元混杂。成年小鼠的单侧orexin神经元数量为2212±144个,MCH神经元数量为3032±82个,MCH神经元在单侧脑区的数量上大概是orexin神经元的1.3倍。Orexin神经元在背-腹(dorsal ventral,D-V)轴的分布距离要广于MCH神经元,但在喙尾(rostra caudal,R-C)轴和内外(medial lateral,M-L)轴的范围则小于MCH神经元。Orexin和MCH神经元均主要分布在LHA、ZI、DMH、后下丘脑(posterior hypothalamus,PH)、前旁丘脑底核(preparasubthalamus,PST)、旁丘脑底核(parasubthalamus,PSTN)六个亚脑区,但两种神经元在这些不同的亚脑区中分布模式和数量均有差异(n=3,P0.05)。其中LHA的两种神经元数量都远远超过其他亚脑区,且orexin神经元数量更多;PSTN区的两种神经元数量分布则比较均衡,而ZI、DMH、PH区,皆以MCH神经元为主。2.成年orexin、MCH和GABA神经元沿R-C轴呈现不同的分布模式Orexin和MCH两种神经元在每个亚脑区的R-C轴总数量差别明显,为了更加精细的获得R-C轴不同层面的神经元数量分布,我们将R-C轴从喙侧向尾侧进行分割,约120μm作为1个单位条带(S),共9个。在不同的亚脑区内,两种神经元数量分布的总趋势从S1到S9都是先增多再减少。GABA神经元主要分布在orexin和MCH神经元间隙及周围,在R-C轴方向从R端到C端变化的过程中,中心位置之前表现为orexin神经元比例增加,MCH和GABA神经元比例下降,主要以GABA神经元下降为主;中心位置之后则表现为orexin神经元比例减少,而MCH神经元和GABA神经元的比例则增加,主要以MCH神经元的增加为主。同时每个亚脑区也有各自的分布特点,大部分亚脑区的orexin神经元数量高峰层出现在MCH神经元的喙侧。另外三种神经元相对细胞密度变化也不同:GABA神经元相对细胞密度没有差异(n=3,P0.05),orexin神经元相对细胞密度则由高密度变为低密度,而MCH反之。3.投射到丘脑室旁核(paraventricular thalamus,PVT)的orexin神经元沿R-C轴呈现先增多后减少的分布模式为了明确orexin神经元向PVT的单级输出,我们利用Vglut-2-cre小鼠在PVT注射AAV-DIO-TVA-EGFP和AAV-DIO-RVG混合液,3周后注射逆行追踪病毒-狂犬病毒(rabies virus,RV),形成起始细胞后进行单级突触逆行追踪,可以直接观察靶向PVT的orexin神经元的分布。结果显示,RV逆行标记与orexin共标的神经元都位于LHA,并由喙侧向尾侧呈现先增多再减少的分布规律。其中,在共标神经元存在的层面中,在orexin神经元分布的偏中心位置(bregma-1.70mm)共标的神经元最多,约12个,而单侧共标的orexin神经元数量占单侧总体orexin数量的12%左右(n=3)。4.Orexin和MCH神经元在发育不同时期神经元大小变化从个体角度对神经元的大小进行分析,利用免疫荧光技术双重标记orexin和MCH神经元,在同样的放大倍数下,可以清晰的看到神经元大小的改变。用横断面长径(transection major axis,TMaA)和横断面短径(transection minor axis,TMiA)作为衡量神经元大小的指标,结果显示:相比出生后1天(postnatal 1,P1),orexin和MCH神经元的TMaA和TMiA均在P7发生了明显增大(n=3,P0.05),而P14并没有与P7的大小显现出差别(n=3,P0.05)。两种神经元的TMaA和TMiA在P21时,达到了成年神经元大小的水平,但P14和P21在神经元横断面长度上仍有差异(n=3,P0.05)。5.Orexin和MCH神经元在发育不同时期径向距离变化从径向距离的长度进行下一步分析:orexin神经元的M-L轴和D-V轴长度逐渐增加至P14,然而MCH神经元仅在P7和P21时显示出R-C轴的增加。但两种神经元的R-C轴并没有在P21时达到成年的稳定状态。另外,orexin神经元在D-V轴上的生长速度比M-L轴和R-C轴更快,而MCH神经元在M-L轴上的生长速度则快于其他两个轴。两种神经元之间的比较则更加有规律,从P1到成年(P56),二者在D-V轴长度上表现出明显的差异(n=3,P0.05)。6.Orexin和MCH神经元在发育不同时期数量和三维分布模式变化Orexin和MCH神经元从P1到P21的整体分布三维模式没有明显变化,仅在P14MCH神经元喙侧的腹侧部分,观察到该部分的神经元数量有明显增加,并且这种改变持续至P21和成年。Orexin和MCH神经元的总数量均在P14达到成年水平,且在P21维持总数量的不变。但各亚脑区的数量在发育过程中存在一些差异:orexin神经元在PeF_2区的P7到P14间,以及LHA_2区的P1到P7间,数量有明显的增加(n=3,P0.05);MCH神经元在DMH_2区的P7到P14间,以及LHA_2区的P1到P7间,数量有明显的增加(P0.05)。而在我们观察的整个发育时期,DMH_2区的orexin神经元和PeF_2区的MCH神经元在数量上有轻度增加,但差异无统计学意义(n=3,P0.05)。这些结果表明,orexin和MCH神经元的总数量均在P14时达到成年水平,但由不同亚脑区的数量增长造成的。综上所述,我们探讨了小鼠HP以orexin为主体的区域内与MCH、GABA神经元的分布模式,建立起整体和各亚脑区的三维分布模式,对已有研究做了补充和完善,更加直观、具体、详细的观察以神经元而非脑区为主体的整体形态,在三维空间上更好的还原脑中的立体图像,有利于功能环路的精确定位。对于orexin和MCH神经元的出生后发育变化的形态学研究,通过探索出生后两种神经元发育变化的三维分布和形态特征,可以帮助我们进一步明确其解剖机制,从形态学发育的角度加深对功能行为正常发展变化的认识。
【图文】：

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图 1 Amria5.4.1 软件图形用户界面。（A）通道选择以及 voxel size 设定。（B）LabelField 模块对 orexin 和 MCH 神经元进行 1 比 1 标记示意。2.1.2.7 神经元计数，单个神经元大小和径向距离测量两位经验丰富的实验者分别统计和计算 orexin 和 MCH 神经元的数量，以减少错误。当发生大的偏差时，第三位实验者重新计数。在 Adobe Photoshop CS6 软件中手动计数 orexin 和 MCH 神经元的数量。选择具有清晰核的神经元用于细胞计数分析。在 ZEN 数字成像软件中随机选择神经元测量大小。每只小鼠在每 2 张切片中选择 1~2个神经元进行测量，选择具有清晰核的神经元，确定神经元直径：横断面长径（transectionmajor axis, TMaA）和横断面短径（transection major axis, TMiA）（图 2）。在 Adobe Photoshop CS6 软件中测量 orexin 和 MCH 神经元径向分布距离：喙侧-尾侧（rostra caudal, R-C）轴、背侧-腹侧（dorsal ventral, D-V）轴、内侧-外侧（medial lateral,

径向分布,神经元,距离测量,径向分布

对 orexin 和 MCH 神经元进行 1 比 1 标记示意。2.1.2.7 神经元计数，单个神经元大小和径向距离测量两位经验丰富的实验者分别统计和计算 orexin 和 MCH 神经元的数量，，以减少错误。当发生大的偏差时，第三位实验者重新计数。在 Adobe Photoshop CS6 软件中手动计数 orexin 和 MCH 神经元的数量。选择具有清晰核的神经元用于细胞计数分析。在 ZEN 数字成像软件中随机选择神经元测量大小。每只小鼠在每 2 张切片中选择 1~2个神经元进行测量，选择具有清晰核的神经元，确定神经元直径：横断面长径（transectionmajor axis, TMaA）和横断面短径（transection major axis, TMiA）（图 2）。在 Adobe Photoshop CS6 软件中测量 orexin 和 MCH 神经元径向分布距离：喙侧-尾侧（rostra caudal, R-C）轴、背侧-腹侧（dorsal ventral, D-V）轴、内侧-外侧（medial lateral,M-L）轴，三个轴向距离皆为最远神经元之间的垂直距离（图 2）。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R338

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