“通督启神”法不同电针对AD模型小鼠海马COX-2、TGF-β1表达的影响

发布时间：2020-05-09 07:07

【摘要】：1.研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD),又称老年性痴呆,属于中枢神经系统退行性疾病,以学习功能出现障碍及记忆力逐渐减退为主要临床表现,在老年群体中属于常见病和多发病,其发病率较其他疾病而言相对较高,而且发病率与年龄之间存在着密切的联系,其发病率随着年龄的增大而增加。根据国际阿尔茨海默病协会(ADI)发布的报告显示,目前世界上患AD的人数约为4700万人,预计到21世纪50年代的时候,全球AD患者的人数将会是现有患者人数的两倍多,约为1.135亿,如此庞大的患者群体将会给世界各国带来沉重的经济负担和社会负担,因此,AD受到世界医学界的高度重视,已经成为现在医学界亟待攻克的难题,但是AD的发病机制非常复杂,每种发病机制不是单一存在的,而且各种发病机制相互交织,相互影响,共同导致AD的发生,随着近几年对AD研究的逐步深入,单一机制尚不能完全解释AD的发生。越来越多的学者认为炎性反应是AD发病的主要机制,在AD的发生、发展过程中起重要作用,在AD患者脑内,炎性反应存在于疾病的各个阶段。本课题组前期的研究证实:“通督启神”针法具有治疗AD的作用,其可能作用机制是抑制了小胶质细胞的活化,减少了炎性介质的释放,从而降低了炎性介质对大脑的损害。小胶质细胞的活化及其相关炎症介质的释放与AD的发生、发展密切相关,本研究以此为切入点,分别采用脉冲电针和音乐电针对模型小鼠进行治疗,运用Morris水迷宫、免疫组化及Western blot技术,从活体到病理组织等不同层面来观察模型小鼠海马小胶质细胞活化后产生的炎症因子的变化以及行为学变化,来探析“通督启神”法不同电针治疗AD的科学内涵及其可能作用机制,为该病的临床治疗探索新的方案,并提供科学合理的实验证据。2.研究目的本研究通过采用“通督启神”法不同电针来治疗7月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠,运用Morris水迷宫观察模型小鼠的空间学习能力和和空间记忆能力的变化,并运用分子生物学方法来检测海马内相关炎性因子COX-2、TGF-β1的表达水平的变化,来探析在“通督启神”法理论的指导下不同电针治疗AD的可能作用机制,并比较音乐电针与脉冲电针治疗AD的疗效差异。3.研究方法分组:本实验将40只SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组、药物组、脉冲电针组和音乐电针组,每组10只,另外,10只相同月龄和相同遗传背景的C57BL/6雄性小鼠作为正常对照组,体重为24.6±4.3g。干预方法:正常对照组:相同饲养条件下不进行任何治疗,在其他各组治疗时将其抓入自制的鼠套内,20min后拆开鼠套将其放入鼠笼内,以确保干预条件与其他组相一致,每天抓取1次,共15天。模型组:处理方法与正常对照组相同。药物组:选用盐酸多奈哌齐灌胃给药治疗,剂量为0.92mg/kg,用药前将药物粉碎成粉末,然后用蒸馏水溶解,每天治疗1次,连续治疗15天,在其他组接受治疗时,将其抓入自制鼠套内,20min后拆开鼠套放回鼠笼中,以确保干预条件与其他组相一致。脉冲电针组:治疗时将其抓入自制鼠套内固定,然后对其进行治疗,所选穴位为“通督启神”法针灸协定处方,即百会穴、印堂穴和人中穴,所选针具为中研太和牌一次性无菌针灸针,针刺人中穴时,采用的是点刺法,不留针,百会穴和印堂穴均向后上方平刺,针刺深度约为0.5cm,然后用韩式电针仪的两极分别连接两针的针柄,波形选用疏密波,输出的频率大小为2～50Hz,每天治疗1次,每次20min,连续治疗15天。音乐电针组:针刺方法同脉冲电针组,针柄连接ZJ-12H音乐电针治疗仪,选用抗痴呆音乐处方,每天治疗1次,每次20min,连续治疗15天。检测方法和指标:15天治疗完毕后,采用Morris水迷宫定位航行实验检测小鼠的空间学习能力,采用Morris水迷宫空间探索实验检测小鼠的空间记忆能力,采用免疫组织化学方法检测小鼠海马COX-2、TGF-β1的表达情况,采用Western blot方法检测小鼠海马COX-2、TGF-β1蛋白的相对表达量。4.研究结果4.1 Morris水迷宫实验结果4.1.1隐蔽平台实验结果经过一段时间的训练学习,各组小鼠的逃避潜伏期均有不同程度的缩短,因此,Morris水迷宫隐蔽平台实验适用于本研究。正常对照组的下降趋势最为明显,说明其学习记忆能力较好,模型组的逃避潜伏期下降趋势较为平缓,学习记忆能力较差,药物组、脉冲电针组和音乐电针组逃避潜伏期的下降趋势介于正常组和药物组之间,说明药物、脉冲电针和音乐电针三种不同的治疗方法均能在一定程度上改善模型小鼠的空间学习能力,且脉冲电针组逃避潜伏期的下降趋势较药物组明显,音乐电针组逃避潜伏期的下降趋势较脉冲电针组明显。在训练的第1天,模型组的逃避潜伏期已与正常组出现了统计学差异(P0.05),在训练的第2至5天,两组之间逃避潜伏期的差异进一步加大(P0.01),说明7月龄APP/PS1双转基因小鼠存在明显的空间学习能力障碍。在训练的第3至5天,药物组、脉冲电针组和音乐电针组的逃避潜伏期均短于模型组(P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均能够提高小鼠的空间学习能力。在训练的第4至5天,脉冲电针组和音乐电针组的逃避潜伏期明显短于药物组(P0.05),音乐电针组的逃避潜伏期短于脉冲电针组,但两者之间没有统计学差异(P0.05)。4.1.2空间探索实验结果模型组目标象限游泳时间在总时间中的占比明显低于正常对照组(P0.01),表明APP/PS1双转基因小鼠存在明显的空间记忆能力障碍。药物组、脉冲电针组和音乐电针组目标象限游泳时间在总时间中的占比明显高于模型组(P0.05、P0.01、P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均可以改善AD模型小鼠的空间记忆能力,其中音乐电针组优于药物组(P0.01),药物组与脉冲电针组、脉冲电针组与音乐电针组之间无统计学差异(P0.05),音乐电针组目标象限游泳时间在总时间中的占比高于脉冲电针组,但两者之间没有统计学差异(P0.05)。模型组穿越平台次数明显少于正常对照组(P0.01),说明APP/PS1双转基因小鼠存在明显的空间记忆能力障碍。药物组、脉冲电针组、音乐电针组穿越平台次数多于模型组(P0.05、P0.05、P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均可以改善AD模型小鼠的空间记忆能力,其中药物组、脉冲电针组、与音乐电针组之间无统计学差异(P0.05),音乐电针组穿越平台次数多于脉冲电针组,但两者之间没有统计学差异(P0.05)。4.2免疫组化DAB染色结果COX-2主要在小鼠海马中的小胶质细胞的细胞膜和细胞质中表达。阳性细胞呈棕色,主要主要染色在细胞膜上,胞浆中也有轻微少量的着色,TGF-β1主要在小鼠的海马中表达,表达部位为小胶质细胞的细胞膜,细胞质和轴突,阳性细胞为黄色颗粒。与其他组相比,正常对照组阳性细胞数较少,细胞染色浅,模型组阳性细胞数明显高于正常对照组,且着色较深,药物组和脉冲电针组与模型组比较,阳性细胞数量相对较多,颜色也较深。与模型组相比,药物组和脉冲电针组的数量相对较少,且颜色也较淡。各组小鼠海马区COX-2、TGF-β1的阳性细胞数统计学分析结果:模型组的阳性细胞数明显多于正常对照组(P0.01),说明7月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑内出现了明显的炎性反应,炎性因子COX-2、TGF-β1的表达增加。药物组、脉冲电针组和音乐电针组的阳性细胞数均明显少于模型组(P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均可降低AD模型小鼠脑内炎性物质COX-2、TGF-β1的表达。药物组、脉冲电针组和音乐电针组之间无统计学差异(P0.05),音乐电针组的阳性细胞数少于脉冲电针组,但两者之间无统计学差异(P0.05)。4.3 Western blot 检测结果模型组COX-2的相对表达量明显多于正常对照组(P0.01),说明7月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑内出现了明显的炎性反应,炎性因子COX-2的相对表达量增加。药物组、脉冲电针组和音乐电针组的COX-2的相对表达量均明显少于模型组(P0.05、P0.01、P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均可降低AD模型小鼠脑内炎性物质COX-2的表达。药物组、脉冲电针组和音乐电针组之间无统计学差异(P0.05),音乐电针组的COX-2的相对表达量少于脉冲电针组,但两者之间无统计学差异(P0.05)。模型组TGF-β1的相对表达量明显多于正常对照组(P0.01),说明7月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑内出现了明显的炎性反应,炎性因子TGF-β1的相对表达量增加。药物组、脉冲电针组和音乐电针组的TGF-β1的相对表达量均明显少于模型组(P0.05、P0.05、P0.01),说明经过15天的治疗,药物、脉冲电针和音乐电针均可降低AD模型小鼠脑内炎性物质TGF-β1的表达。药物组、脉冲电针组和音乐电针组之间无统计学差异(P0.05),音乐电针组的TGF-β1的相对表达量少于脉冲电针组,但两者之间无统计学差异(P0.05)。5.研究结论(1)本实验选择的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠在7月龄时已经了学习记忆功能的障碍和小胶质细胞的活化及炎性因子的释放,是研究AD较为理想的动物模型。(2)在“通督启神”法理论指导下,脉冲电针和音乐电针均可提高模型小鼠的空间学习能力和空间记忆能力,但两者之间无统计学差异,仅从数值上看出音乐电针组优于脉冲电针组。(3)“通督启神”法脉冲电针和音乐电针均可减轻AD模型小鼠海马组织炎性细胞因子COX-2、TGF-β1的表达,但两者之间无统计学差异,仅从数值上看出音乐电针组优于脉冲电针组。
【图文】：

避潜伏期的下降趋势较药物组明显，音乐电针组逃避潜伏期的下降趋势较脉冲电针组明逡逑显。逡逑如表１、图２所示，，在训练的第１天，模型组的逃避潜伏期己与正常组出现了统计逡逑学差异（Ｐ＜0．0５），在训练的第２至５天，两组之间逃避潜伏期的差异进一步加大（Ｐ＜０．０１），逡逑说明７月龄ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因小鼠存在明显的空间学习能力障碍。在训练的第３至５逡逑天，药物组、脉冲电针组和音乐电针组的逃避潜伏期均短于模型组（Ｐ＜０．０１），说明经逡逑过１５天的治疗，药物、脉冲电针和音乐电针均能够改善模型小鼠的空间学习能力。在逡逑训练的第４至５天，脉冲电针组和音乐电针组的逃避潜伏期明显短于药物组（Ｐ＜０．０５），逡逑音乐电针组的逃避潜伏期短于脉冲电针组，但是两者没有统计学差异（Ｐ＞０．０５）。逡逑４５逡逑

２．１逦Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验结果逡逑２．１．１逦Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫隐蔽平台实验结果逡逑如表１、图３所示，经过一段时间的训练学习，各组小鼠的逃避潜伏期均有不同程逡逑度的缩短。正常对照组的下降趋势最为明显，说明其学习记忆能力较好，模型组的逃避逡逑潜伏期下降趋势较为平缓，说明学习记忆能力较差，药物组、脉冲电针组和音乐电针组逡逑逃避潜伏期的下降趋势介于正常组和药物组之间，说明药物、脉冲电针和音乐电针三种逡逑不同的治疗方法均能在一定程度上改善模型小鼠的空间学习能力，其中，脉冲电针组逃逡逑避潜伏期的下降趋势较药物组明显，音乐电针组逃避潜伏期的下降趋势较脉冲电针组明逡逑显。逡逑如表１、图２所示，在训练的第１天，模型组的逃避潜伏期己与正常组出现了统计逡逑学差异（Ｐ＜0．0５），在训练的第２至５天，两组之间逃避潜伏期的差异进一步加大（Ｐ＜０．０１），逡逑说明７月龄ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因小鼠存在明显的空间学习能力障碍。在训练的第３至５逡逑天
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245;R-332

【参考文献】

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本文编号：2655777