体外共培养体系诱导大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化的研究

发布时间：2020-05-13 12:51

【摘要】：女性盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)是由于盆底支持结构薄弱及损伤所引起的一组疾病,主要包括压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脱垂(pelvic orgen prolapse,POP)。盆底支持结构主要由肌肉、韧带、筋膜和神经组成,相互连接成一个复杂、动态和协调的系统,保护盆底脏器,为排尿功能、排便功能、性功能等功能提供了基本保障。盆底任何部分的损伤都会导致其功能受损,这时就会出现一系列有关的临床症状。随着人口的老龄化,盆底疾病的发病率预计将急剧上升。肌肉的损伤被认为是盆底功能障碍疾病发生的第一个也是最重要的原因,因为它的强度减弱,使盆腔脏器发生移位,进而出现功能异常。对于PFD的治疗有两种,非手术治疗和手术治疗,都有其不足之处,所以,需要一种新的方法使损伤盆底肌肉恢复其正常结构和功能。随着组织工程学的发展,为盆底肌肉修复提供了新的手段。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因具有两种重要特性:自我复制,向多种细胞系分化的能力,比如骨细胞、软骨细胞、肌细胞等,成为组织工程学种子细胞,且取材方便,这些特点为其在修复盆底肌肉、治疗PFD方面提供了理论依据。目的探索在体外条件下如何诱导BMSCs成肌分化。因此,本实验中我们采用BMSCs与正常及机械牵张后的大鼠盆底肛提肌卫星细胞分别间接共培养的方法,研究体外条件下诱导BMSCs成肌分化。研究方法(1)利用密度梯度离心法获得大鼠BMSCs,纯化传代培养。通过观察细胞形态与流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达的方法对其进行鉴定。并诱导其向成骨细胞分化证明其分化潜能。(2)利用酶消化法获得肛提肌卫星细胞,纯化传代培养,通过观察细胞形态和常规免疫荧光检测Desmin的表达进行鉴定。(3)取第3代80%融合的大鼠肛提肌卫星细胞,分别负载10%形变,1Hz单向水平牵张刺激0、6、12 h。通过鬼笔环肽染色观察不同时间牵张后肛提肌卫星细胞骨架。(4)将大鼠BMSCs与未牵张及牵张12h后的大鼠盆底肛提肌卫星细胞间接共培养6天,采用实时定量RT-PCR检测BMSCs中MyoD和Desmin mRNA的表达;采用免疫蛋白印记(Western-blot)检测BMSCs中MyoD和Desmin蛋白的表达。使用SPSS 21.0软件进行数据分析处理,数据均采用?x±s表示。用one-way ANOVA检验样本与对照组的组间差异,以α=0.05作为检验水准。结果(1)第四代BMSCs多为漩涡状或平行排列生长,形态较为均一。CD34(1.8%)和CD45(3.7%)分子为阴性表达,CD44(98.8%)和CD90(99.0%)为阳性表达。且所得细胞可以被诱导为成骨细胞。(2)获得的大鼠的盆底肛提肌卫星细胞胞体细长,呈梭形,大小和形态均一,排列均匀有序,折光性较强。细胞培养至第3代,Desmin免疫荧光检测呈阳性表达,符合大鼠的盆底肛提肌卫星细胞特征。(3)显微镜下观察染色的卫星细胞骨架情况,结果显示:肌动蛋白纤维(F-actin)红色荧光染色强,分布均匀。机械牵张后,F-actin红色荧光分布仍均匀、整齐,但强度减弱,且随机械牵张时间的延长,红色荧光强度的减弱更加明显,细胞变狭长。(4)RT-PCR和Western-blot检测不同共培养体系中BMSCs MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达情况,结果显示::与对照组相比,共培养组和机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达量均增高(P0.05);与共培养组相比,机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达量增高(P0.05)。结论(1)BMSCs与正常盆底肛提肌卫星细胞和机械牵张后的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养均可诱导BMSCs成肌分化。(2)与机械牵张后的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养诱导BMSCs成肌分化的作用更强。
【图文】：

表面抗原,大鼠,茜素红,橘红色

图 3.2 第四代大鼠 BMSCs 表面抗原分子的表达a：CD34；b：CD45；c：CD44；d：CD903.1.3 成骨诱导分化结果茜素红染色结果显示：成骨诱导后，，形成了明显的橘红色结节（钙盐与茜素红形成），说明所得细胞可以被诱导为成骨细胞。（图 3.3）

大鼠,表面抗原,橘红色,诱导分化

图 3.2 第四代大鼠 BMSCs 表面抗原分子的表达a：CD34；b：CD45；c：CD44；d：CD90诱导分化结果染色结果显示：成骨诱导后，形成了明显的橘红色结节，说明所得细胞可以被诱导为成骨细胞。（图 3.3）c
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】