甲醛灭活对呼吸道合胞病毒融合蛋白构象的影响及灭活疫苗的初步研究

发布时间：2020-05-13 18:47

【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种可引起严重下呼吸道疾病的最重要的病原体之一,易感人群为婴幼儿、老年人及免疫缺陷者。2周岁以下的婴幼儿均感染过RSV,每年有2.5-4%的婴幼儿因感染RSV而住院,给全球卫生医疗事业带来了沉重的经济负担。RSV至今缺乏安全有效的疫苗,Palivizumab(Synagis(?))是唯一一株经过美国FDA批准上市的用于RSV预防药物。但是由于其效价不足、使用剂量高、价格昂贵,该抗体仅仅被用于免疫缺陷及先天性心脏病等高危新生儿预防RSV的感染。20世纪60年代研究者们为预防RSV的感染向一部分婴幼儿使用了针对RSV的福尔马林灭活全病毒疫苗(FI-RSV)。然而当受试儿童再次暴露于RSV后,急性下呼吸道感染的频率和严重程度显著增加并最终导致受试者中两名幼童发生死亡,这种增强的RSV疾病称之为ERD(enhanced RSV disease)。之后的数十年间,各种疫苗设计策略被应用于RSV疫苗研究中,许多亚单位、减毒、基因工程备选疫苗纷纷进入临床,但始终未能获得成功。在RSV病毒表面的两个主要膜蛋白G蛋白和F蛋白被认为是最主要的诱导中和抗体应答的免疫原,其中G蛋白在不同型别间存在较大的差异,而F蛋白则较为保守,因此F蛋白一直是疫苗研究的最主要的靶标,针对F蛋白的抗体Palivizumab的成功应用也进一步的支持了这一观点。随着对F蛋白结构的深入解析,研究者发现RSV的F蛋白存在两种构象,即pre-fusion构象和post-fusion构象,Palivizumab所识别的表位在两种构象上均有分布,而特异性识别pre-fusion构象的抗体则展示出比Palizivumab高10-100倍的体外中和效价,这表明pre-fusion构象的F蛋白是诱导中和抗体应答的更为主要的靶构象。通过基因工程改造的较为稳定的pre-fusion F蛋白免疫后的诱导的中和抗体应答也明显优于post-fusion F蛋达2-4倍。进一步的研究还发现二十世纪60年代失败的FI-RSV疫苗,其病毒表面F蛋白则主要为post-fusion构象,这表明FI-RSV无法有效诱导出针对RSV的高效中和抗体,因此推断FI-RSV失败的原因很可能是由于免疫后所诱导的弱中和抗体无法有效抑制RSV的感染,同时这些弱中和抗体结合复制产生的病毒产生了大量的免疫复合物并堆积在呼吸道引起疾病增强。相比于其他疫苗类型,全病毒灭活疫苗呈递的抗原表位最全面且最接近天然状态,因此在本研究中我们希望尝试探索出合适的灭活条件和疫苗保存条件以最大程度地保留病毒表面pre-F蛋白。结果显示出在天然RSV病毒表面,pre-fusion构象的F蛋白的极不稳定的,在4℃下放置72 h后病毒表面的大部分pre-fusion构象会消失,F蛋白主要以post-fusion构象存在。而当使用浓度为0.2667%-0.0156%的甲醛灭活12h后,病毒表面有40%-60%的pre-fusionF蛋白被保留下来,并且在放置72h后检测依然维持这一比例。而在未经甲醛灭活病毒表面,pre-fusionF蛋白在相同条件下保留不足20%。这表明在合适的浓度下,甲醛在灭活病毒的过程中,能够同时稳固病毒表面的pre-fusion F蛋白。我们同时发现在FI-RSV的处理条件下(甲醛终浓度为0.01%)无法稳固pre-fusion F蛋白,72 h灭活后病毒表面的F蛋白主要为post-fusion构象。此外,我们还发现在330mM以上的盐离子溶液中也有利于病毒表面pre-fusionF蛋白的稳定,但不会稳固pre-fusionF蛋白,去除高盐溶液后pre-fusion F蛋白依然会逐步降低,这表明330mM以上的盐离子溶液可以作为有效的保藏条件使用。因此本研究结合优选的灭活条件和保存条件最终获得的灭活病毒最终能够维持表面80%-90%的pre-fusion F蛋白。进一步的小鼠免疫评估结果显示,从免疫后血清中和抗体水平中发现,相同免疫剂量下优选条件的中和抗体水平大约是FI-RSV组4-5倍升高,并且所有免疫剂量下小鼠血清中和抗体水平均能达到保护感染的有效的血清中和抗体水平。在随后的攻毒结果也显示出,阳性组和FI-RSV组在攻毒后第7天均有明显的体重下降,大约下降了 20%左右,而优选条件组除了在低剂量免疫组第2天有轻微的体重下降外,其余免疫组体重均保持95%以上;同时在攻毒后鼻肺部病毒滴度检测结果中也显示,除了对照组其余均没有明显的病毒检出;后期我们还对小鼠肺组织进行炎症病理评估,从肺部病理切片以及肺部炎症量化结果来看,优选疫苗组的炎症均弱于对照组和FI-RSV组,这表明优选疫苗免疫后能够很好地保护小鼠抵抗RSV感染,减轻RSV感染造成的肺部炎症。综上所述,我们最终希望将探索得到的优选条件和评估结果可以为RSV疫苗的研发提供扎实的理论和实践基础。
【图文】：

呼吸道合胞病毒,病毒粒子,电镜观察,蛋白

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＳＶ邋ｖｉｒｏｎ邋ＥＦ邋ＳＥＭ逡逑１．３呼吸道合胞病毒的基因组和编码蛋白逡逑ＲＳＶ基因组（图１－２）为单股非节段的负义链ＲＮＡ，全长１５，１９１－１５，２２６核苷逡逑酸（ｂｐ）。如果将ＲＳＶＡ２邋（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．Ｍ７４５６８）是ＲＳＶＡ亚型标准毒株，，转逡逑录１０个基因（从３’至５’端依次为ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２、Ｌ），逡逑共编码１１种蛋白，除了Ｍ２基因编码两种蛋白，分别是Ｍ２－１、Ｍ２－２，除此以外逡逑每个基因只编码一种蛋白。其中Ｆ邋（融合蛋白）、Ｇ邋（黏附蛋白）、ＳＨ邋（小疏水逡逑蛋白）为跨膜糖蛋白，Ｍ、Ｍ２－１、Ｍ２－２为基质蛋白，Ｎ邋（核壳蛋白）、Ｐ邋（磷酸逡逑蛋白）、Ｌ邋（大聚合酶蛋白）为核衣壳蛋白，ＮＳ１、ＮＳ２为非结构蛋白。逡逑Ａ逡逑ＮＳ２逦ＳＨ逦Ｍ２＊１邋Ｍ２－２逦．逡逑．ＮＳ１邋Ｎ邋Ｐ邋Ｍ邋Ｇ邋Ｆ邋？ｓＦ逡逑３邋ｔｒ逡逑Ｉ邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１￣，＾邋１邋ｈ逡逑０逦２邋４逦６逦８逦１０逦１５邋ｋｂ逡逑３逡逑

基因组,跨膜蛋白,病毒株,表达蛋白

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【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】