PI3K通过控制Pax5的表达水平来调节IgE的类别转换

发布时间：2020-05-14 05:05

【摘要】：研究背景及目的过敏性疾病主要导致自身生理功能紊乱,并伴有血清中免疫球蛋白E(Immunoglobin E,IgE)的升高,如过敏性鼻炎,哮喘等,该类紊乱性疾病在近10年内急剧增长,几乎已经达到近流行病的比例~([1])。磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)在B淋巴细胞的类别转换中具有重要的调节作用。配对盒蛋白5(Paired box protein 5,Pax5)在B细胞发展成熟的早期阶段是一种重要的调节因子,在早期可以表达B细胞特异性活化蛋白BSAP(B-cell lineage specific activator protein,BSAP)。它的异常表达也可能导致机体淋巴瘤的产生。该分子的存在对抗体转录本的表达有重要的调节作用。但是PI3K对IgE转换的调节作用的具体机制还没有被探索,因此本研究旨在于探索PI3K信号通路在IgE类别转换作用以及与Pax5等转录因子的相互调节关系。方法1)选取RPMI8266和U266两种人多发性骨髓瘤细胞,选取PI3K的两种不同活性抑制剂LY294002,PIK-293提前作用于上述两种细胞1h后,给予对照组和实验组同时刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗体2d,提取RNA,通过QPCR测定AID和εGLT的表达量,同时通过流式单染试验测IgE的表达比例,判定两种抑制剂对IgE产生的有效性。2)对两种细胞进行PI3K的抑制(15μM的LY294002),p-AKT的抑制(20μM的PHT-427)以及两种抑制剂同时抑制处理,1h后给予对照组和实验组同时刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗体2d,提取细胞的RNA,通过实时荧光定量PCR测定AID和εGLT的表达量,来判断PI3K通路对Ig E的抗体转换是否通过p-AKT。3)对两种细胞进行PI3K siRNA,Pax5 siRNA以及两种siRNA的混合转染处理,6h后给予结果对照组和实验组同时刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗体2d,提取细胞的RNA,实时荧光定量PCR测定AID和εGLT的表达量,同时测定上清IgE的浓度,来判断PI3K对IgE的抗体转换是否通过Pax5蛋白分子的作用。4)选取C57B/L雌鼠20只,分为对照组,4mg/kgLY294002处理组,所有小鼠提前一周买回来放动物房稳定,一周后给予每只小鼠腹腔注射OVA和AL(OH)_3混合PBS溶液100ul,一周之后处理组小鼠每只小鼠每天按照4mg/kgLY294002的浓度腹腔注射,一周和两周之后取小鼠脾脏和眼球取血,脾脏平分一半放入4%的多聚甲醛保存做免疫组化,另一半-80℃保存,通过免疫组化进一步验证Pax5的表达在PI3K通路中的作用。结果1)通过流式,实时定量PCR对AID,εGLT的测定,我们选出对PI3K活性抑制效果好的抑制剂LY294002。2)ELISA实验,流式测定IgE+B细胞的比例,我们发现LY294002对Ig E的产生具有浓度依赖的特性(P0.05);通过Western Blot实验,我们发现抑制剂LY294002对PI3K活性的抑制也有浓度依赖的特征(P0.05)。3)通过PI3K抑制剂LY294002,AKT的抑制剂以及两种抑制剂共同抑制,实时定量PCR对AID,εGLT的测定,我们发现PI3K对IgE的抗体转化并不通过p-AKT这个分子(P0.05);LY294002浓度梯度实验发现在IgE产生的过程中Pax5分子的表达上调。4)通过对两种人多发性骨髓瘤细胞用PI3K-siRNA,Pax5-siRNA的转染以及共转染,发现共转染的效果在两个单独转染之间(P0.05),可以假设PI3K活性的抑制对IgE的转换作用可能是通过Pax5分子。5)用LY294002对小鼠制作急性致敏模型,发现实验组比对照组的血清IgE的含量要高(n=10,F=107.463,P0.01),免疫组化发现Pax5分子比对照组表达量升高(P0.05),抑制因子Id2的表达量降低(P0.05)。结论PI3K活性的抑制可以增强IgE的类别转换,并且通过控制Pax5分子的表达来调节IgE的生成。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 丘雅维;杨惠玲;;PI3K通路及其抑制剂抗肿瘤的研究进展[J];中山大学学报(医学科学版);2009年S3期

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本文编号：2662839