hPAQR7介导人成熟精子响应孕酮的作用和机制

发布时间：2020-05-14 09:00

【摘要】：背景:哺乳动物精子在睾丸中发生发育并在附睾中成熟后,并不完全具有授精能力。当精子进入雌(女)性生殖道后,理化环境的改变激发精子的获能、超活化、趋化性和顶体反应等重要生理功能,使得精子与卵细胞成功受精。研究表明,卵泡液、卵丘细胞分泌液和透明带都能够诱导和激活精子上述重要生理功能。孕酮是卵泡液和卵丘细胞分泌液中的有效成份之一,能够在短时间内引起钙离子内流和氯离子外流,同时增加细胞内环化腺核苷酸含量,调节精子的获能、顶体反应、超活化和趋化性等重要生理功能。因以上孕酮介导的效应不通过调控基因表达实现,故被称为人精子孕酮非基因组效应。近年来,主流观点认为孕酮是通过激活人精子特异性钙通道CatSper引起钙信号的变化来实现对精子相关生理功能的调控,但目前关于孕酮是否直接作用于CatSper仍存在较多争议。最近Miller等人的研究发现孕酮在活化人精子质膜上的水解酶ABHD2后,ABHD2继而可以水解人精子膜上抑制CatSper通道开放的大麻素2-AG,并最终导致CatSper通道激活,这提示孕酮并不是通过直接结合CatSper通道激活其钙电流。然而,尚缺少更为直接的证据证实ABHD2是人精子孕酮受体。孕酮-脂联素受体(progestin adiponectin Q receptor,PAQR)属于一类新命名的膜蛋白受体家族,其成员具有G蛋白偶联受体类似的7次跨膜结构域。目前该家族在人类中有11个成员,包括孕酮受体和脂联素受体两个亚群。其中,人孕酮-脂联素受体7(hPAQR7,亦被称作mPRα)属于PAQR家族中的孕酮受体亚群,主要在卵巢和睾丸等生殖相关组织中表达。同位素标记的孕酮结合实验结果表明hPAQR7与孕酮的结合具有高亲和性饱和性特异性和可逆性等特征,符合孕酮受体的特点。最为重要的是,在人成熟精子细胞膜上中能检测到hPAQR7蛋白,主要定位在精子尾部,且其功能可能与人成熟精子运动有关。然而,作为人精子中孕酮膜受体的理想候选蛋白,hPAQR7在人成熟精子响应孕酮过程中所起作用及其机制尚不清楚。实验目的:本文旨在揭示hPAQR7介导人成熟精子响应孕酮的作用和机制,补充和完善现有孕酮对人精子CatSper激活机制,并为男性不育诊疗提供新的分子靶标。实验方法:1)免疫组化检测hPAQR7在成年人和老年人睾丸中的表达和分布情况;2)反转录PCR和免疫印迹检测人成熟精子中是否存在hPAQR7的转录本和蛋白质;3)亲和素亲和层析和超高分辨显微技术验证孕酮与人精子中hPAQR7的结合并进一步检测孕酮-hPAQR7在人精子中的结合部位;4)精子穿透甲基纤维素实验评价人精子超活化运动能力;5)金霉素染色(CTC)评价人精子发生顶体反应的概率;6)单细胞钙成像系统检测人精子胞内钙浓度变化情况;7)Western blotting定量分析人精子中hPAQR7含量;8)超分辨显微技术检测孕酮与hPAQR7在人精子中的结合部位;9)免疫荧光验证hPAQR7、CatSper、ABHD2在人精子中的共定位;10)精子膜片钳技术记录hPAQR7抗体对孕酮激活人精子CatSper通道电流的影响;11)免疫共沉淀技术验证hPAQR7、CatSper、ABHD2是否存在相互作用。结果:1)hPAQR7主要表达在人睾丸生殖细胞中,越靠近腔体的生殖细胞中表达越高,且老年人睾丸中hPAQR7含量降低,提示hPAQR7可能与精子功能有关;2)人成熟精子中能检测到hPAQR7转录本和蛋白,且hPAQR7为膜蛋白,主要定位于精子尾部;3)孕酮结合于人精子头部和尾部,hPAQR7能结合孕酮且结合孕酮的hPAQR7主要分布在人精子尾部;4)针对hPAQR7膜外段设计的hPAQR7单克隆抗体能显著抑制孕酮对人精子胞内钙含量增加以及对CatSper电流的激活效应,这提示hPAQR7可能通过介导孕酮激活CatSper通道所导致的钙信号变化,最终影响孕酮对人精子功能的调控过程;5)免疫共沉淀实验结果表明hPAQR7抗体可以与CatSper及ABHD2受体形成免疫复合物,此结果表明hPAQR7与CatSper、ABHD2受体间存在相互作用,而这进一步暗示hPAQR7-CatSper-ABHD2在人精子中形成复合物调控人精子孕酮非基因组效应;6)临床样本筛查结果表明,男性不育病人中有42%病例精子响应孕酮能力下降(钙信号和CatSper电流),且在这些男性不育病例中50%以上hPAQR7含量降低。这表明hPAQR7含量降低在精子响应孕酮能力下降类男性不育症中扮演重要角色。结论:综上所述,我们认为hPAQR7在介导人成熟精子响应孕酮过程中起到重要作用,且可能通过孕酮-hPAQR7-ABHD2-CatSper这一调控机制介导人精子孕酮非基因组效应。
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第 1 章引言物附睾中精子成熟后，一旦进入雌性生殖道后，便致力于完成精卵结合过程此时并不是每个精子都具有成功受精的能力，仅有少数精子能够在接受到生殖道环境内的某些生理因子的刺激后发生获能过程[6]。现已有大量研究表精子进行获能过程中伴随着 Ca2+浓度的增加、可溶性腺苷酸环化酶、酪氨酸化、PKA 和 PKC 等水平的升高[7-11]。其中，，精子钙浓度的改变以及蛋白水变化被认为对精卵结合过程具有重要作用。精子在获能后，其运动方式逐渐变化，例如鞭毛鞭打的频率及幅度增加，鞭打方式由对称，高频，低幅转变对称，低频，高幅度，即超活化运动[12]。精子的这类超活化运动可以确保精有充足的动力穿过卵细胞的透明带。在精卵结合的过程中，精子将会发生有其受精的顶体反应，使得其细胞核可以进入卵细胞中并最终顺利完成整个过程。哺乳动物受精过程如图 1.1。

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第 1 章引言应等）[13]，因此，孕酮是调节精子功能的重要生理激素，且精子对孕酮的正常响应能力是精子成功受精的重要保障。目前，关于孕酮调控精子功能的具体机制亦得到了广泛的研究。一般认为，由于成熟精子是核基因转录沉默的特化细胞，故孕酮对成熟精子的作用被称为非基因组效应（non-genomic progesterone actions）[14]。研究表明在哺乳动物成熟精子中没有检测到孕酮核受体（nPR，nucleaprogestin receptor），并且 nPR 的抑制剂和转录抑制剂并不能阻断孕酮对精子的作用[15,16]。因此，孕酮的非基因组效应不是由传统的孕酮核受体介导的，而主要是通过激活精子上的膜孕酮受体（mPR，membraneprogestinreceptor）从而调控其下游的信号通路来实现的，因此这种效应不会改变细胞核的基因表达。长期以来，不同的研究小组尝试从精子细胞膜中筛选孕酮结合蛋白，但现阶段仍缺少充分的实验证据来证明这些蛋白是孕酮膜受体[16-18]。因此，至今为止孕酮调控精子功能的具体有关机制尚不完全清晰。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R321

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