解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体的构建及表达

发布时间：2020-05-16 02:32

【摘要】：目的构建解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体并表达蛋白。方法根据NCBI上公布的解脲脲原体UP3_c0006基因序列设计上、下游引物,以解脲脲原体基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,采用经酚氯仿法回收、纯化。BamHI和NotI酶分别对目的基因和原核表达载体pGEX-6P-2进行双酶切,酶切片段在T4连接酶作用下连接,连接产物经热休克法转化感受态大肠埃希菌XL1-Blue。转化菌接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养,进行菌落PCR筛选及测序验证。重组质粒转化菌用IPTG诱导3h,超声裂解菌体经GST Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白GST-UP3_c0006并进行SDS-PAGE鉴定。结果 PCR扩增UP3_c0006基因片段长327bp,构建的UP3_c0006原核表达载体转化XL1-Blue后进行菌落PCR鉴定,目的片段约为477bp,与预期相符。对重组菌扩大培养并提取质粒进行基因测序,结果与NCBI中UP3_c0006基因序列完全一致;诱导表达的重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白GST-UP3_c0006分子质量单位约为38×103,与预期相符。结论成功构建了pGEX-6P-2-UP3_c0006原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得融合蛋白的表达,该蛋白主要存在于重组菌超声裂解上清中。

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本文编号：2666018