抗人神经菌毛素1b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用初探

发布时间：2020-05-16 05:49

【摘要】：神经菌毛素1(Neuropilin1,NRP1)作为一种跨膜糖蛋白在轴突导向,血管生成和肿瘤免疫等多种反应过程中发挥着重要的作用。研究发现,NRP1是血管内皮生长因子(VEGF)的非酪氨酸激酶受体,促进VEGF与其受体(VEGFR)的结合,对血管生成具有极大的促进作用,其中b1b2结构域是其与VEGF165的主要结合位点。研究发现,NRP1高表达于多种肿瘤细胞表面,尤其是上皮细胞肿瘤。阻断NRP1不仅能直接对肿瘤细胞的迁移及肿瘤的发生发展产生抑制作用,而且能够阻断其与VEGF165的结合,间接抑制肿瘤局部血管的生成与发展,继而影响肿瘤的生长发展。因此,NRP1有望成为抗肿瘤治疗的新突破点。本研究首先通过PCR技术得到人NRP1 b结构域(HuNRP1b)的编码序列,并将其克隆入原核表达载体,经表达、纯化后,获得重组HuNRP1b蛋白;将重组HuNRP1b蛋白免疫小鼠,制备出抗HuNRP1b单克隆抗体(McAb)。随后,采用体内、体外实验分析McAbs结合肿瘤细胞的能力及抑制血管生成的活性,为其后续的抗肿瘤研究提供基础。一.重组HuNRP1 b结构域蛋白的获得利用PCR方法得到HuNRP1b的编码基因,构建重组质粒pET30a-HuNRP1b,经双酶切和测序验证后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组表达菌BL21(pET30a-HuNRP1b)。经0.6 mM/L IPTG进行低温诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白His-HuNRP1b的表达。经变性、复性、纯化等步骤制备可溶的重组蛋白。经SDS-PAGE分析,融合蛋白His-HuNRP1b成功获得表达、纯化,浓度约为3.0mg/ml。二.制备抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体并分析其生物学特性选取8wkBalb/c鼠,将上述获得的纯化蛋白His-HuNRP1b进行小鼠腹部皮下免疫,100μg/只,免疫3次,间隔2wk。第一次免疫,将纯化His-HuNRP1b与等体积完全弗氏佐剂混合,充分乳化后在小鼠腹部皮下进行多点注射。再次免疫,佐剂更换为不完全弗氏佐剂,抗原、剂量、免疫途径均同上。1wk后,取小鼠眼眶下静脉丛血,检测其血清效价,取效价高者进行加强免疫。加强免疫时,采用尾静脉直接注射不加任何佐剂的His-HuNRP1b。3 d后取免疫鼠脾脏,制备单细胞悬液,与sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将阳性杂交瘤细胞株经过2-3次亚克隆后得到稳定的单克隆细胞株,小鼠腹腔注射法制备腹水McAbs。采用Western-Blot、间接免疫荧光法(IFA)、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学法(IHC)研究McAbs的生物学特性。本研究共获得4株腹水McAbs,分别为1H4、2G7、3H4、8G9,它们的ELISA效价依次为 1:256 000、1:64 000、1:256 000、1:128 000,亚类分别为:IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b。Western-Blot鉴定结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)只与融合蛋白HuNRP1b结合而不与空载体表达菌结合,在36 kDa的位置出现特异性条带;且该McAbs可以与高表达天然HuNRP1的乳腺癌细胞株(MCF-7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231)结合,在大小约120 kDa的位置有特异性条带。表明本研究所获得的McAbs不仅可以识别重组HuNRP1 b结构域蛋白而且可以识别全长的HuNRP1。IFA结果表明,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)可以与人脐静脉内皮细胞(HUVEC),人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)及人白血病细胞株(k562)结合,观察到亮绿色荧光,表明所获得的McAbs均能够特异性识别天然的HuNRP1。ICC结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)作用于HUVEC细胞及MDA-MB-231细胞时,在胞膜及胞浆内可见棕褐色信号,其中McAbs:2G7、3H4、8G9结合能力较强。4株McAbs采用IHC实验分析临床样本的结果表明,在9例乳腺癌样本中McAbs分析发现有6例呈HuNRP1阳性;7例肺癌样本中有3例呈阳性;3例食管癌及3例肾癌均呈阳性,这与商品化的抗用HuNRP1抗体检测结果一致。表明获得的McAbs可以特异性识别肿瘤细胞及肿瘤组织中的HuNRP1。三.抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体抑制血管生成活性的研究运用Transwell小室迁移实验,分析McAbs对HUVEC细胞的迁移的影响。在小室的下室加入10ng/ml VEGF165,上室分别加入终浓度为50 ng/孔的McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)阻止细胞向下迁移,每组设三个复孔,同时设PBS组作为对照。实验结果显示,McAbs(1H4、2G7、8G9)相对于PBS组细胞迁移抑制率约为15%,3H4组未表现出抑制作用。运用Matrigel体外成管实验分析McAbs对HUVEC细胞体外成管的影响,细胞接种后,每孔加入10 ng/ml VEGF165刺激细胞成管,实验孔加入McAbs(1H4、2G7、8G9),50ng/孔,设PBS孔作对照,继续培养6h,镜下观察细胞成管情况,发现PBS组的HUVEC细胞可以形成明显管状结构,而McAbs组大部分细胞仍附于Matrigel表面生长,抑制率约为10%,体外实验表明McAbs(1H4、2G7、8G9)对于局部血管生成具有一定的抑制作用。利用鸡胚尿囊膜血管生成实验,进一步分析McAbs对新生血管发生发展的影响。以硅胶环作为载体在健康发育的鸡胚内血管生长相对不丰富位置分别放入McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9),保持终浓度为100 ng/枚,同时设终浓度为100 μg/枚的地塞米松组作为阳性对照,设PBS100μL/枚作为阴性对照。结果显示,McAbs(1H4、8G9)组及地塞米松组鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长受到了明显的抑制,但McAbs(2G7、3H4)组抑制效果较不明显。最后,采用SCID小鼠体内种植Matrigel小体实验研究McAb对动物体内血管的生成的抑制作用。将100μgMcAb1H4、5×106MCF-7细胞与500μ1Matrigel混匀,于SCID小鼠腹部皮下注射。6天后取出小鼠体内种植的Matrigel小体,观察小体内血管的发育情况,并对其进行包埋、制成切片,通过苏木素-伊红(HE)染色及IHC方法进一步分析Matrigel小体内血管的发育。HE染色和IHC实验发现McAb 1H4可以干扰Matrigel小体内MCF-7细胞对小体内血管生成的吸引作用。综上所述,本研究成功制备出4株抗HuNRP1bMcAb,且具有识别天然HuNRP1的能力。其中,McAbs 1H4、2G7、8G9具有一定的体外抑制HUVEC迁移及成管能力,其中McAb 1H4具有体内抑制肿瘤血管生成的能力。该特异性McAb的获得为研究靶向抑制肿瘤部位血管生成及肿瘤的发生、发展提供了生物材料。
【图文】：

分析图,质粒,重组质粒,基因

３．１．１逦ＨｕＮＲＰｌ１）基因扩增逡逑以ＨｕＮＲＰｌ的全长ｃＤＮＡ作为模板利用设计的上下游引物采用ＰＣＲ技术扩增出逡逑ＨｕＮＲＰｌｂ的基因。结果如图１－丨所示，泳道１中的大小约为９００邋ｂｐ左右的特异性条带为目逡逑的条带，且大小与ＧｅｎＢａｎｋ上公布的ＨｕＮＲＰ邋１ｂ基因序列大小相同表明成功扩增出ＨｕＮＲＰ邋１ｂ逡逑区基因。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋Ｉ逡逑！！！■逡逑２５００逡逑０００逦＾＿逡逑．．沁逡逑２５０逡逑■■■■逡逑图ｌ－ｌ．ＨｕＮＲＰｌｂ基因ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳分析图逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＨｕＮＲＰ邋ｌｂ逡逑Ｍ．ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１．邋ＨｕＮＲＰｌｂ邋基因邋ＰＣＲ邋产物逡逑３．１．２重组质粒ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌｈ的构建逡逑３．１．２＿邋１重组质粒ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰ邋１ｂ的双酶切鉴定逡逑选择上述菌液ＰＣＲ鉴定结果正确的菌液用小提试剂盒提取质粒，测定质粒浓度后，进逡逑行双酶切鉴定。结果如图１－２所示，重组质粒经双酶切后鉴定后出现了两个条带，且其位置逡逑大小分R%与质粒及目的基因一致，则选取该重组质粒，送至上海生工生物工程有限公司进逡逑行测序，序列比对的结采卜源性为１００邋％，表明重组质粒ｐＥＴ３0ａ－ＨｕＮＲＰ邋１ｂ得到成功构建。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１逡逑ｉ５000ＭＢ逡逑５000ＬＪＬ｜｜＾￣逡逑２５００逡逑２偏逡逑图１－２．重姐质粒ｐＥＴ３（３ａ－ＨｕＮＲＰｌｂ双酶切鉴定图逡逑

浓度分析,融合蛋白,洗脱,体表

将重组质粒ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ重转化入细菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态菌，获得重组表达菌逡逑ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）。分别将该重组菌与空载体表达菌ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ）经０．６邋ｍＭ／Ｌ的逡逑ＩＰＴＧ诱导表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果如图１－３所示，泳道２约３６邋ｋＤａ的位置有一条特异逡逑性条带，其大小与目的蛋白的分子量大小相同，而经ＩＰＴＧ诱导后的空载体表达菌在这一逡逑位置没有出现明显条带，，表明融合蛋白ＨｕＮＲＰｌｂ得到成功表达，表达产物主要以包涵体的逡逑方式存在。逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１逦２逦３逦４逡逑—■■邋■邋■－邋■邋■邋■邋邋：卜—办．ｉ＇＇＇玫逡逑３０邋：：：逦．逡逑９５…＝逡逑４３逦？逡逑２６、“＇邋．．．．邋－逡逑图邋１－３邋ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）表达产物的邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋分析逡逑Ｆｉｇ．１－３邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ＨｕＮＲＰｌｂ邋ｉｎ邋ＢＬ２１邋（ＰＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＩＰＴＧ逡逑Ｍ．邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋ｌ．ＢＬ２１（ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌ
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392-33

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