肠道病毒71型2C蛋白调节NF-κB活化的机制研究

发布时间：2020-05-16 06:47

【摘要】：肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)可引起手足口病、严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等,具有较高的病死率和致残率。EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属,是单链正股RNA病毒,其正链的RNA基因组被翻译成一个多聚蛋白,经过自身剪切,最终形成结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。目前EV71的致病机理有待阐明。 EV712C蛋白含329个氨基酸,分别与同属的柯萨奇病毒A16型和脊髓灰质炎病毒的同源性达97.5%和63.3%,相对保守。NF-κB蛋白家族在宿主抵抗病毒感染过程中起着关键作用。在宿主细胞的正常生理状态下,p65和p50与IκB-α/β在细胞质中形成非活化状态的三聚体,在受到外界多种信号刺激下,通过信号转导途径,IκB-α/β被降解,活化后的p65和p50二聚体从细胞质中迁移到细胞核中,与细胞核中特异DNA序列结合,启动基因转录,引起细胞因子、趋化因子、粘附因子等表达,使得宿主对病毒侵染产生天然免疫和适应性免疫应答。目前可通过自身蛋白抑带NF-κB信号途径的病毒有cowpox virus, coxsackieviruses, hepatitis C virus, HIV-1, poliovirus, SARS-coronavirus等。 我们通过酵母双杂交方法以EV712C蛋白为诱饵进行了大规模的酵母双杂交筛选人cDNA文库,得到其中一个候选蛋白是p65。我们通过免疫共沉淀和GST pull down技术证实了EV712C和p65相互作用,经激光共聚焦观察EV712C和p65在细胞内存在共定位。为了明确与2C相互作用的p65蛋白区域,我们针对p65进行了截短突变,最终将作用区域定位于194-290氨基酸p65的IPT结构域,此结构域是p65与p50形成二聚体的结合区域,实验表明2C能通过与IPT结构域相互作用削弱p65和p50的结合。为明确与p65的相互作用的2C蛋白区域,我们针对2C进行了截短突变,将作用区域定位于105-125氨基酸和126-263氨基酸。通过NF-κB报告基因检测发现105-125和126-263氨基酸片段都能抑制NF-κB舌化。我们将2C截断突变体1-104,1-113,1-117,1-121,1-125氨基酸区段进行了报告基因检测,发现五个突变体皆抑制NF-κB活化。据报道,2C1-125aa抑制IKKβ磷酸化而抑制NF-κB活化,我们采用免疫共沉淀方法,发现IKKβ与2C1-104和105-125氨基酸皆有作用,2C105-121氨基酸与IKKβ相互作用而不与p65IPT功能域相互作用。 综上所述,我们首次鉴定了EV712C与p65相互作用,并阐明2C可通过与p65的IPT结构域结合抑制p65和p50二聚体形成,提出了EV71拮抗天然免疫的新机制。
【图文】：

中国医学科学院/北京协和医学院 博上学位论文构，无包膜和突起，直径约24-30 nni。EV71病毒基因组编码的VP1、VP2、VP3、VP4四个多肽构成原聚体，原聚体经拼装成为具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自结构域相互连接，最终形成病毒的外壳，，VP1、VP2、VP3三个多肽暴露在病毒外壳表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密相连[17]。Wang等人于2012年解析/ EV71衣壳蛋白的晶体结构[18]。

1.1.2基因组结构EV71基因组约7400个核苷酸的单股正链RNA，病毒的单链RNA具有感染性。病毒基因组两端为保守的非编码区（UTR)，5’末端共价结合一个小分子蛋白Vpg,与病毒RNA合成和基因组装配有关。在3’末端有多聚腺甘酸（polyA)尾，如果去除3’末端多聚腺甘酸（polyA)尾或基因组出现断裂，感染性消失，而5’末端共价连接的蛋白对病毒的感染性没有明显影响[20]。EV71基因组仅有一个^u放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白(polyprotein)。在多聚蛋白合成的同时，被自身蛋白酶切割继而产生PI、P2-P3两个前体蛋白。P1前体蛋白经过进一步加工，最终形成VP1、VP2、VP3和VP4四个形成病毒外壳的结构蛋白。P2-P3前体蛋白被进一步切割和加工，最终形成7个非结构蛋白，分别是2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。四个结构蛋白形成的外壳蛋白与复制的病毒RNA包装成成熟的病毒颗粒，7个非结构蛋白虽然不是病毒颗粒的组成部分，但在病毒侵染和复制过程中发挥非常重要的作用。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【共引文献】

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本文编号：2666341