鼠衣原体TC0668蛋白生物学特性的初步研究

发布时间：2020-05-16 09:58

【摘要】：目的:构建鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)TC0668蛋白的原核表达质粒pGEX4T-tc0668,诱导GST-TC0668重组蛋白在大肠杆菌表达并纯化,制备目的蛋白鼠源性多克隆抗体和兔源性多克隆抗体,测定TC0668在HeLa细胞中的定位、时相表达及诱导细胞因子的表达情况,为了解TC0668在鼠衣原体致病过程中的作用机制,进而研究其在沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)中的同源蛋白CT389奠定了基础。方法:1.利用软件比对TC0668蛋白和Ct毒力因子CT389蛋白的相似性。利用Sopma软件分析它的二级结构。采用在线软件Swiss-model搜索与TC0668蛋白结构最为接近的蛋白质,然后利用该蛋白为模板模拟TC0668蛋白的三级结构。2.根据tc0668基因序列设计特异性PCR引物,以Cm野生型基因组为模板进行PCR扩增tc0668基因。回收目的片段与双酶切的pGEX4T-1相连,构建表达重组质粒p GEX4T-tc0668,转化大肠埃希菌(E.coli BL21),使用IPTG诱导GST-TC0668重组蛋白的表达,用GST-琼脂糖树脂纯化GST-TC0668重组蛋白,然后去内毒素。3.将GST-TC0668重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔并收集抗血清,测定抗血清与GST-TC0668重组蛋白的反应及效价,纯化获得的目的蛋白鼠源性多克隆抗体和兔源性多克隆抗体。4.预备单层HeLa细胞,以实验室保存的Cm NiggⅡ菌株感染单层HeLa细胞0、4、8、12、16、20和24h,收集感染后各个时间点感染标本的总RNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RTq-PCR)检测tc0668的mRNA水平,WB和间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测4、8、12、16、20和24h感染标本的TC0668蛋白表达情况。5.预备单层HeLa细胞,用Cm NiggⅡ菌株感染单层HeLa细胞24h,以IncA、HSP60等蛋白为对照,利用IFA检测感染24h后感染细胞中TC0668的定位情况。并通过感染周期不同时间点的IFA进一步确证。6.预备单层HeLa细胞,分别用等量的Cm tc0668单基因突变菌株(Cm tc0668~(mut))和对应的Cm tc0668单基因野生型菌株(Cm tc0668~(wt))感染单层细胞,24h后收集上清和细胞裂解液,用蛋白芯片检测细胞上清液和裂解液中的细胞因子水平。结果:1.生物信息学结果显示,tc0668和ct389基因及其编码产物的相似性高达84%和92%,TC0668蛋白α-螺旋、无规卷曲和β片层的含量分别为17.4%、60.78%和21.81%。2.PCR扩增获得大小约1227 bp的目的片段,与tc0668基因预期大小相符合。将其连接到表达载体p GEX4T-1,获得重组质粒pGEX4T-tc0668。重组质粒转化大肠埃希菌E.coli BL21,IPTG诱导表达分子质量约为72 kDa的GST-TC0668重组蛋白,与预期值相符。经GST琼脂糖树脂柱层析纯化,得到GST-TC0668重组蛋白。3.GST-TC0668重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,收获的免疫血清经纯化分别获得鼠源性和兔源性的多克隆抗体,经检测多克隆抗体均能识别GST-TC0668重组蛋白,且效价≥1:64000。4.IFA对Cm Nigg II菌株感染HeLa细胞24h后表达的内源性蛋白进行定位,TC0668抗体标记与IncA抗体标记相似,而与Pgp3和HSP60不同的信号。5.RTq-PCR结果显示,Cm感染HeLa细胞4h后,tc0668基因开始转录,16h表达量明显升高,之后维持高转录水平,WB和IFA结果显示,TC0668蛋白于4h开始产生,于16h左右显著增多,且持续到感染周期结束。6.Cm tc0668~(mut)和Cm tc0668~(wt)菌株感染HeLa细胞24h后收集上清和细胞裂解液,用蛋白芯片检测细胞因子表达情况。与Cm tc0668~(wt)菌株相比,tc0668~(mut)菌株的感染细胞上清中有73个细胞因子表达下调,其中有统计学差异的有36个(P0.05);33个细胞因子表达上调,其中有统计学差异的有10个(P0.05)。收集的细胞裂解液中,相比于Cm tc0668~(wt)菌株,tc0668~(mut)菌株的感染细胞裂解液中表达上调和下调的细胞因子部分与上清一致,另一部分则刚好相反。结论:1.TC0668蛋白可能为衣原体的一种早期分泌的包涵体膜蛋白。2.TC0668蛋白可能通过调控细胞因子的表达影响生殖道病变。
【图文】：

氨基酸序列,相似性分析,氨基酸序列,氨基酸

TC0668 氨基酸序列分析和蛋白结构预测将两基因编码蛋白质的氨基酸序列进行相似性分析，发现 TC0068 蛋白10 个氨基酸，与 CT389 相同的氨基酸数目为 389 个，与 CT389 不同的个氨基酸，氨基酸序列的相似性高达 92%（图 2）。通过分析，Cm TCt CT389 蛋白具有高度的同源性。

示意图,二级结构,示意图,基因

图 1.3 TC0668 蛋白的二级结构示意图Fig 1.3 Secondary Structure of TC0668 ProteinPrediction of secondary structure of TC0668 protein using Sopma software, blue for alpha helix,red for extended strand and purple for random coil.4.3 pGEX4T-1/tc0668 原核表达载体构建及鉴定4.3.1 tc0668 基因 PCR 扩增结果对 Cm 基因组中的 tc0668 基因进行 PCR 扩增，取 4μL 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，在大小约为 1227bp 位置可见清晰的特异性条带，，与 tc0668 的预期片段大小相符。1500bpM 1 2
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R374

【参考文献】