兔骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞完全缺乏模型眼表的分化

发布时间：2020-05-16 13:54

【摘要】：背景:严重的角膜缘干细胞缺乏会导致失明,而干细胞治疗为此类患者带来了复明的希望。目前自体角膜缘组织和角膜缘干细胞移植已经在临床上取得了显著的效果。但当双眼的角膜缘干细胞严重缺乏不足以分离培养时则需要寻找合适的干细胞来源,而骨髓间充质干细胞由于其众多优点被广泛用于实验研究中。已有研究报道在体外将骨髓间充质干细胞成功地诱导为角膜样上皮细胞,但是对于骨髓间充质干细胞移植后在体内分化方向的研究尚少。目的:本实验主要观察未经诱导的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后在眼表面的分化情况。方法:3-5月龄清洁级日本大耳白兔24只,采用角膜缘环形板层切除术加中央角膜上皮刮除术建立兔右眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,4周后观察眼表形态,行苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及DAPI染色鉴定模型成功与否,选取成功模型中的18只(36只眼),应用随机数字表法分为三组包括模型组,单纯羊膜移植组,BMSCs联合羊膜移植组,其中每组6只(兔右眼),而正常对照组为18只成功模型兔的左眼。取第三代(P3)兔BMSCs,以去上皮羊膜为载体培养观察,待细胞铺满羊膜达90%以上时进行移植手术,于移植术后12周观察兔右眼表形态,行HE染色观察角膜结构,免疫荧光检测角膜上皮细胞(CECs)分化标记物CK3+12的表达。结果:建模后4周有21只兔右眼眼表形态评分达到7分及7分以上,取3只行HE染色、PAS染色、DAPI染色,模型组HE结果显示角膜缘及角膜上皮细胞层被清除,浅基质层有大量炎症细胞浸润及新生血管形成,PAS染色可见杯状细胞形成及新生血管形成,DAPI染色显示上皮层未见细胞核,浅基质层细胞核明显增多,说明模型构建成功。移植术后12周照相观察眼表形态,与自身兔左眼角膜相比,模型组兔右眼角膜混浊,有大量新生血管,羊膜组右眼角膜轻度混浊,有少量新生血管,羊膜加BMSCs组兔右眼角膜透明,未见新生血管;HE染色显示羊膜加BMSCs组角膜结构修复完整,免疫荧光检测到羊膜加BMSCs组有角膜分化的特异性标记因子CK3+12表达,而羊膜组未见表达。结论:兔BMSCs移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后,在体内能够分化成兔CECs或角膜样上皮细胞,恢复眼表结构及功能。
【图文】：

形态图,建模,形态,角膜

石蜡包埋，切片，烤片，切片再继续脱蜡水化，分组后制作好的切片再进行染色。2.2 结果2.2.1 建模步骤及术后眼表形态观察建立兔角膜缘干细胞缺乏模型的步骤：角膜缘环形板层切除（图 2.2.1A），中央角膜上皮刮除（图 2.2.1B），术后角膜缘环完整去除，角膜上皮层完整刮除，角膜轻度水肿，仍透明（图 2.2.1C）。术后 3 天与 4 周眼表形态与术前相比较：术前角膜透明无水肿，虹膜纹理清晰，瞳孔清晰，无新生血管（图 2.2.1D），建模后 3 天角膜呈中度水肿混浊，虹膜纹理及瞳孔不清晰，有细小新生血管形成（图 2.2.1E），建模后 4 周与正常兔眼相比，角膜轻度水肿，重度混浊，虹膜纹理及瞳孔不可见，明显有新生血管长入角膜（图 2.2.1F）。观察到第 4 周模型各项指标基本稳定。

荧光色素,建模,周变化,混浊度

2.2 建模后各时间点眼表形态评分分别于建模术后当天、术后 1 周、2 周、3 周、4 周对模型眼角膜混浊程度，皮荧光色素染色及新生血管形成情况进行评分（参照综述中的表 1），通过统计析及作图发现，角膜浑浊度第 1 周变化最显著，第 2-4 周基本稳定，混浊度评分 2 分以上；建模术后立即行上皮荧光色素染色观察到全部角膜黄染，后每周着面积较前缩小，第 3-4 周趋于稳定，各象限均有点片状着色，着色评分在 2 分以；角膜新生血管数量每周递增，第 4 周后未见明显增多，评分可达 3 分以上。见，在第 4 周时，各单项评分达标，眼表综合形态评分也已达 7 分以上，由此出，，第 4 周模型的眼表形态基本稳定（图 2.2.2）。
【学位授予单位】：湖北医药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332;R772.2

【参考文献】