Wnt2蛋白与人间充质干细胞体外衰老相关性的探索分析

发布时间：2020-05-18 12:22

【摘要】：实验目的:本研究通过对人间充质干细胞(Human mensenchymal stem cells,hMSCs)发育相关的经典Wnt/β-catenin信号通路分析,探究Wnt家族因子在hMSCs中的表达和生物学作用,以寻找能代表hMSCs发生体外复制性衰老(Replicative senescence)的一种标志性分子,以便将来可能为hMSCs质量评价提供新的技术策略。实验方法和结果:本课题利用Real Time-PCR检测了不同hMSCs细胞株的不同代次中多种Wnt亚型分子基因的转录水平,试图找到与复制性衰老的关系;通过不同代次hMSCs标准细胞株,确定Wnt2亚型分子的转录水平与hMSCs复制性衰老的负相关性。结果显示,Wnt2表达量普遍高于其他Wnt分子,并且不同代次hMSCs标准细胞株中,Wnt2亚型分子的转录水平随代次升高表达量下降。另外,将不同来源的hMSCs通过蛋白印迹杂交(Western blot)和ELISA进行Wnt2蛋白表达水平验证后,结果显示Wnt2蛋白表达水平和标准株一致随代次降低;Real Time-PCR相对定量和绝对定量法检测Wnt2也随代次降低。此外,本研究通过Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因TCF1启动子荧光素酶报告系统活性和β-catenin蛋白的入核迁移情况来分析判断外源Wnt2重组蛋白是否能激活其所在的经典信号通路。结果显示,Wnt2可以激活经典信号通路下游靶基因TCF1;可以诱导β-catenin积累入核。利用外源Wnt2重组蛋白对Wnt经典信号下游靶基因WISP1进行激活,证明了Wnt2/β-catenin经典过度激活产生退行性病变的潜在可能。同时,本研究利用H_2O_2诱导的hMSCs衰老模型,进一步探索Wnt2与hMSCs复制性衰老的相关性;利用H_2O_2衰老模型和GSK-3β抑制剂CHIR99021判断GSK-3β与Wnt2表达的关系。结果显示,Wnt2随H_2O_2的浓度升高,表达量下降;GSK-3β随衰老表达升高;GSK-3β水平的增强促进了对Wnt信号的抑制作用;GSK-3β抑制剂CHIR99021一定程度上活化了Wnt2和Wnt经典信号的水平。实验结论:本课题证明了Wnt2是Wnt/β-catenin经典信号通路中与hMSCs复制衰老相关的关键Wnt分子,其表达开始被抑制时可认为细胞步入衰老,因此可作为细胞复制衰老的新型分子标志物,用于判断细胞复制衰老情况。同时,可以考虑检测Wnt2表达水平作为一种新型hMSCs质量评价的方法。
【图文】：

（Casein kinase，CK-I）一起结合，构成多蛋白复合体。蛋白复合物不仅用于β-catenin，，并且复合物中 GSK-3β 磷酸化 β-catenin N-末端[13]，最终 β-catenin 被酶体降解，使细胞质中 β-catenin 保持在低水平[14]，从而阻止 β-catenin 转移入核转录调控作用。其中 Axin 是该复合体的限制组分，通过对 Axin 稳定性的调节直接调节多蛋白复合体的活性[15]。

温度 时间95℃ 5 min95℃ 30 s55℃ 30 s 28 cycles72℃ 30 s72℃ 2 min3.1.1.1 实验结果将 1%琼脂糖胶放置于有 1×TAE 的电泳槽中，使 1×TAE 没过琼脂糖胶的上表面，将 5 μL DNA Marker、10-20 μL PCR 产物分别加入琼脂糖凝胶孔中，凝胶孔在上放在负极，红色正极方向在下远离胶孔，将电压调至 80 V 后开始电泳，30-60 min 后，取出琼脂糖凝胶，关闭电泳电源，用凝胶成像仪扫描，可得图 2：
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

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本文编号：2669709